reforef.ru 1

Bryan Lllewellyn. Hematoxylin & Eosin. Last updated: December 2005. www.stainsfile/info


http://stainsfile.info/StainsFile/stain/hematoxylin/mordant_hemalum.htm
Состав квасцового гематоксилина
Возможно, единственный самый общеиспользуемый краситель в гистотехнологии для демонстрации морфологии ядер – это гематоксилин или гематеин. Такие растворы обычно содержат гематоксилин и квасцы и называются гемалаунами или квасцовыми гематоксилинами. Предложено много формул. Здесь, например, включено более 50 формул растворов гемалауна. Разница в количестве гематоксилина, количестве и типе солей алюминия, растворителей, окисляющих агентов и стабилизаторов. Эти изменения порой противоречивы и сделаны вопреки основным принципам, на которых базируются эти растворы и это затрудняет понимание.
Как минимум, имеется три основных пункта, необходимых для производства эффективной окраски ядер квасцовым гематоксилином:

  • Гематоксилин или гематеин как красители

  • Соли алюминия как протравы

  • Самый простой растворитель – вода


Дополнительно к этим трем пунктам можно добавить другие компоненты. Они не существенны, но модифицируют поведение растворов в некоторых случаях. Они включают:

  • Окисляющие агенты для превращения гематоксилина (предшественника красителя) в гематеин (краситель).

  • Кислоты для регулировки рН, изначально для увеличения срока жизни раствора, но они могут повлиять на избирательность окраски в зависимости от раствора.

  • Стабилизаторы для подавления дальнейшего окисления после того, как гематеин сформирован, поскольку это может укоротить жизнь раствора и давать плохо определяемые ядра.

Добавки к растворителям также общие, часто используют для торможения испарения или образования осадков.

Из-за своего значения окисление или созревание превращение гематоксилина в гематеин – предмет отдельного обсуждения. Принципы, по которым протравы присоединяются к некоторым красителям – также предмет отдельной дискуссии, хотя специфическое применение гематеина здесь кратко упоминается. На этой странице сделан акцент на отношениях между красителем и протравой и влиянии добавки кислоты.
Гематоксилин



Гематоксилин


Гематеин

 

Из двух вышеприведенных структурных формул видно, что гематоксилин и гематеин отличаются только одним атомом водорода. Удаление этого водорода из гематоксилина выполняется естественным атмосферным кислородом или использованием мягких окисляющих агентов и в результате получается состав с гидроксильной группой с прилежащей карбонильной группой. Эта конфигурация облегчает формирование координационного комплекса с металлами, но без ограничения с алюминием. Таким образом, алюминий может быть воспринят как связка или мост между анионным красителем гематеином и отрицательно заряженными фосфатными группами ядра.



Прилежащие гидроксильная и карбонильная группы гематеина


Координационный комплекс между гематеином и алюминием

 

Координационный комплекс этого типа образуется с ковалентными связями между алюминием и кислородом гидроксильной группы и координационной связью между карбонильным кислородом и тем же самым атомом алюминия. Таким способом алюминий твердо присоединяется к молекуле. Этот способ называется хелатированием, поэтому иногда это соединение называется хелатом. Тем не менее, поскольку вовлекается краситель, более широко оно называется лаком. Этот лак – красящий компонент растворов гемалауна. Простейшее объяснение – это то, что он реагирует как катион и притягивает анионы ткани, такие как фосфатные группы ДНК и карбоксильные группы белков. Более полное – это то, что он притягивается как минимум к ДНК посредством ковалентных а также координационной связей.


Количество гематоксилина в разных растворах варьирует широко – от 1 грамма на литр в растворе Mayer до двадцати в растворе Masson. Несомненно, фактическое содержимое красителя должно воздействовать на свойства окраски и это можно увидеть, что раствор с большим содержанием красителя, вероятнее всего, будет окрашивать регрессивно. Большинство прогрессивных растворов имеют около 1 г в литре или немного больше, а регрессивные растворы имеют 4 или более грамм в литре. Тем не менее, содержание красителя само по себе не определяет этой характеристики. И количество протравы и рН также влияют. В общих чертах, однако, более вероятно, что при неизменной концентрации протравы раствор с низким содержанием красителя будет более селективным для ядер, чем с высоким содержанием. Это можем быть достаточно просто проиллюстрировано добавлением больших количеств созревшего 10% спиртового гематоксилина к 5 мл 10% раствора квасцов и затем доведения объема до 10 мл водой.
Протрава

Обычная протрава для окраски ядер с гематоксилином – это квасцы или двойной сульфат алюминия. Алюмокалиевые или алюмоаммонийные квасцы самые часто используемые, хотя это не причина для того, чтобы не использовать алюмонатриевые квасцы. Обычное объяснение для такого использования квасцов состоит в том, что квасцы хорошей чистоты были доступны в конце 1800-х, когда эти растворы были введены. Было просто и удобно использовать их, предпочитая другим источникам алюминия. Конечно, второй металл в двойном сульфате не должен быть обладать действием протравы. Gill содержит сульфат алюминия.
Другие соли алюминия также определены. Например, ацетат алюминия в формуле Haug или нитрат алюминия в варианте 1909 г у Rawitz. Более современные гемалуны Gill используют сульфат алюминия. Из этих примеров видно, что источник алюминия не критичен в практике. Кроме того, вопрос чистоты больше не муссируется.

В современной практике чаще всего используют около 50 г квасцов на литр растворителя, главным образом воды. Точка насыщения аммонийных и калийных квасцов составляет 142 г и 139 г на литр воды соответственно. Опубликованы формулы с количеством квасцов в диапазоне от 6 г на литр до 142 г на литр (в одной определено 300 г, но избыток сверх точки насыщения выбрасывается). Сравнительная таблица иллюстрирует содержание красителя и количество протравы в большинстве формул гемалауна.


При взаимодействии гематеина и квасцов образуется лак. Иногда используется нагревание для ускорения этого процесса, но, в конечном счете, это случается независимо от подогрева. Этот лак имеет определенный состав, и в формулах с высоким содержанием любой избыток может привести к выпадению грязного осадка, возможно, из-за продолжающегося окисления гематоксилина. Необходимо также заметить, что гематеин продолжает окисляться в другие соединения, и они также могут выпадать в осадок из раствора вместе с квасцами. Практически это означает, что растворы гемалауна нужно периодически фильтровать, и это должно выполняться, так как это более важно для концентрированных растворов.
Соотношение краситель:протрава имеет важное влияние на характеристики различных рецептов. Подобно тому, как изменяется содержание красителя при сохранении концентрации квасцов, возможно влияние на селективность растворов для ядер, также как и возможно увеличение концентрации квасцов при сохранении концентрации красителя постоянной. Вобщем, чем выше содержание квасцов, тем более вероятной будет ядерная селективность. Опять же, это легко показать приготовлением серии растворов квасцов от 0.1% до 10% и добавкой 0.1 мл созревшего 10% гематоксилина к 10 мл каждого из них.
Обычно этот феномен объясняют тем, что в системе действия масс – это «дополнение» для красителя и протравы, притянутых тканью и протравой, остающейся в растворе. Имеется тенденция красителя к сохранению равновесия между этими двумя составляющими, то есть: если здесь высокое содержание красителя, то соотношение протрава:краситель низкое и равновесие склоняется в пользу ткани. Когда соотношение протрава:краситель высокое из-за низкой концентрации красителя, то равновесие сдвигается в раствор и к ткани притягивается меньше красителя.
Кислоты

Растворы квасцов кислые, например, 0.2 М молярный (5.16%) раствор калийных квасцов имеет рН 3.3. Это очень близко к обычно используемым 50 г в литре. При этой рН лак растворим. Так как раствор используется, и щелочная вода из крана попадает в раствор, рН растет до тех пор, пока лак не начнет выпадать в осадок. Это видно по смене цвета раствора с вишнево-красного на фиолетово-красный. Для того, чтобы это получилось не нужно слишком сильное загрязнение проточной водой. Поэтому неподкисленные гемалауны не имеют длительного срока жизни. Там, где кислота не используется, выгодно промывать срезы дистиллированной водой перед помещением их в раствор гемалауна с тем, чтобы уменьшить любой перенос щелочи.

Изначальная добавка небольших количеств кислот в растворы гемалауна стала общей практикой для увеличения их срока жизни. Чаще всего используется 2-5% уксусная кислота, хотя другие также используются, например, 0.1% лимонная кислота в формуле Langeron 1942. Этот раствор по ошибке обычно называют гемалауном «Mayer». Растворы, содержащие добавки кислоты живут значительно дольше, и когда они, наконец, начинают изменять цвет, их можно омолодить добавкой небольшого количества кислоты. Конечно, имеется предел количеству раз добавления кислот. Однако, это избитая истина, что полезная жизнь растворов гемалауна теснее связана с истощением содержащихся кислот, чем имеющихся красителей. Это особенно характерно для сильных регрессивных формул, где содержание красителя такое высокое, что ими можно пользоваться непрерывно на протяжении месяцев, и за этот период только малое количество будет притянуто ДНК. Опять же, промывка в воде или разведенной кислотой используются для подкисления раствора гемалауна, это выгодно для уменьшения переноса щелочей и увеличивает полезную жизнь раствора.
Наблюдаемый эффект от добавок кислот – это то, что ядерная окраска иногда более селективна. Это более очевидно с теми гемалаунами, которые имеют более низкое содержание красителя. Фактически, некоторые сильные типы, такие как Ehrlich и Lillie значительно не отличаются. Формула Cole 1943 года, тем не менее, имеет заметное другое проявление с более значительной ядерной селективностью. Этот раствор неподкислен, и имеет очень значительное сходство с различными прогрессивными окрасками, подкисление дает более селективную окраску ядер и меньшую окраску цитоплазмы, и это один из лучших примеров того, как количество кислоты улучшает селективность ядер.

Ядерная селективность улучшается, вероятно, из-за небольшого понижения рН при добавлении кислот. Это может быть достаточным для устранения некоторых реакций с кислотными группами цитоплазматических белков. Почему же это работает так в сильных формулах? Может быть потому, что более вероятно, что большее количество красителя будет реагировать с цитоплазматическими группами. Необходимо также заметить, что гематеин может частично притягивать краситель к ткани неионными связями, и присутствие солей может усилить эти диполь-дипольные взаимодействия. Гематеин фактически может быть использован в процедуре типа кармина Best для демонстрации гликогена, методе который, как полагают, зависит от водородных связей.

Поскольку низкая рН может сделать ядерную окраску более селективной, кажется, имеет смысл уменьшать ее до тех пор, пока полностью перестанут окрашиваться карбоксильные группы, и останутся окрашенными только фосфаты ядра. Такой раствор – это гемалаун Carazzi. Он содержит соляную кислоту и очень высоко селективен для ядер с очень светлым неокрашенным фоном. Это может быть самый селективный для ядер из всех прогрессивных гемалаунов. Тем не менее, имеются также и недостатки в том, что при низкой рН в результате удаляются отложения кальция и не видна их локализация, а наличие мелких остатков кальция может быть полезным индикатором.
Эффект от добавки кислот в раствор гемалауна можно увидеть повторением двух ранее описанных упражнений с добавлением 0.2 мл ледяной уксусной кислоты или одной капли концентрированной соляной кислоты в каждый раствор.
Дифференцировка

Регрессивно окрашенные ткани обычно требуют удаление некоторого материала, окрашенного в синий цвет. Количество зависит от частных характеристик используемых формул, но и также от личных предпочтений патологов, которые будут просматривать стекла. Последние могут сильно варьировать, от почти никакого до совсем значительного. Нет «правильной» степени. Некоторые предпочитают темно окрашенный фон, так что они могут обнаружить основное вещество (соединительной ткани) и муцины, какие они находят полезными добавками в заключения. Другие предпочитают светлый фон с чистой и четкой окраской ядер.

Протравные гематоксилины могут быть экстрагированы из тканей несколькими способами. Два самых распространенных – это кислоты и протравы. Первый - это обычно использование 0.5% или 1% соляную кислоту в 70% этаноле (кислый спирт), в то время как последние обычно ограничиваются окраской железным гематоксилином типа Heidenhain и используют протраву для уменьшения силы. Обычно считается, что кислый спирт производит лучше очерченные ядра, особенно с квасцовыми протравами. Дифференцировка протравами дает нечеткие контуры ядер и этого необходимо избегать.

Заключение

Три наиболее влиятельные показателя, определяющие тип окраски, которого нужно ожидать от отдельных гемалаунов:-


  1. количество красителя в растворе

  2. количество протравы и соотношение краситель:протрава

  3. рН

К ним мы должны также добавить, возможно, время применения раствора.
В практическом применении самые популярные формулы разделяются на две группы. Первая из них та, в которой имеется 1 грамм красителя вместе с 50 г квасцов, или около того, и которые окрашивают прогрессивно. Вторая та, в которой имеется 5 г красителя и 50 грамм квасцов или около того, и которые окрашивают регрессивно. Соотношения 1:50 и 1:10 соответственно и они годятся для использования как отправные точки для любого сравнения.
Сказав это, вспомним, что одна очень популярная формула выходит за эти рамки. Гемалаун Harris содержит 5 г красителя и 100 г квасцов (1:20). Интересно, что часто говорят, что раствор будет окрашивать регрессивно без кислоты и прогрессивно с кислотой. Это может быть преувеличением, так требуется короткое время окраски – менее 1 минуты и получается заметный синий фон, но это служит для иллюстрации. Тем не менее, характеристики окраски неиспытанных форм гемалауна могут быть довольно точно оценены при взгляде на количества и соотношения ингредиентов.
Должна быть также возможность для составления заказа гемалауна, основанного на этих принципах. Регулируя количества красителя и протравы для увеличения или уменьшения ядерной селективности необходимо приспособить прогрессивный гемалаун к желаемой степени ядерной и фоновой окраски, которые найдет полезными каждый отдельный работник. За исключением приспособления к виду по этой причине, также очень полезно поупражняться контролированию процесса окраски Г-Э. Это метод такой значимый, что все гистотехнологи должны досконально понимать принципы, и быть способными управлять конечным видом по желанию.

На этих принципах также основано использование других протрав, как например, метахромных железных гематоксилинов, хотя применяются они реже. Соотношение между красителем и протравой является показательным с другими красителями, как минимум с заменителями гемалауна. Конкретно, mordant blue 3 реагирует таким же образом. В практическом использовании, резкая прогрессивная окраска с mordant blue 3 получается при уменьшении количества протравы, поскольку селективность гематоксилина улучшается при увеличении количества протравы.

Имеется также обсуждение окраски гематоксилином и на других гистотехнологических сайтах, например у Roy Ellis.
Ссылки

Baker, John R., (1958)
Principles of biological microtechnique
Methuen, London, UK.

Susan Budavari, Editor, (1996)
The Merck Index, Ed. 12
Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, NJ, USA

Baker, J. R., (1962),
Experiments on the action of mordants: 2. Aluminium-haematein.
Quarterly Journal of Microscopical Science, v. 103, pt. 4, pp. 493-517
Перевод с английского: Пешков М. В. 30 июля – 6 августа 2006.


Перевод с английского: Пешков М. В., 30 июля – 6 августа 2006.