reforef.ru 1 2 3 4


На правах рукописи

Баннур Радуан

Молекулярно-генетические маркеры генов метаболизма коллагена в прогнозировании течения миопии у детей

14.01.07 – глазные болезни

03.02.07 – генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург

2011

Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная

педиатрическая медицинская академия» Министерства здравоохранения

и социального развития России.

Научные руководители:

доктор медицинских наук профессор Бржеский Владимир Всеволодович

доктор медицинских наук профессор Ларионова Валентина Ильинична

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук доцент Коскин Сергей Алексеевич

доктор биологических наук профессор Иващенко Татьяна Эдуардовна
Ведущая организация — ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения и социального развития России.

Защита диссертации состоится « 12 » декабря 2011г. в 14 часов на заседании совета по защиты докторских и кандидатских диссертаций Д 215.002.09 при ФГВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М.Кирова» МО РФ (194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, 6).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М.Кирова» МО РФ.

Автореферат разослан «____» ноября 2011г.


Ученый секретарь совета

доктор медицинских наук

Куликов Алексей Николаевич
Общая характеристика работы

Актуальность. Как известно, миопия является одной из наиболее распространенных глазных нозологических форм у детей и встречается в последние годы у 20-30% учащихся средних школ [Тарутта Е.П., 2006]. При этом практически каждый второй выпускник средней школы имеет миопическую рефракцию [Петухов В.М., Медведев А.В., 2004].


Наряду с широкой распространенностью, миопия представляет актуальность также и в связи с серьезными осложнениями при ее прогрессировании до высоких степеней, заключающимися в изменении биомеханических свойств склеры, развитии дистрофических изменений сетчатки и др. [Иомдина Е.Н. и др., 2011; Ward B. и др., 2011]. В частности, по данным разных авторов, миопия высокой степени является наиболее частой причиной инвалидности по зрению среди лиц молодого возраста, достигая сегодня в отдельных регионах России 24% в структуре инвалидности по зрению [Шкребец Г.В. и др., 2011].

Наибольшее значение имеет осевая миопия, формирующаяся вследствие нарушения внутриутробного развития глаза (при врожденной миопии) или избыточного роста глазного яблока (при школьной миопии).

Осевая миопия значительно распространена при многих наследственных синдромах, связанных с патологией соединительной ткани на почве нарушения метаболизма коллагенов [Иомдина Е.Н. и др., 2011], однако чаще всего встречается в структуре недифференцированной дисплазии соединительной ткани [Jacobi F.K., Pusch C.M., 2010]. Эти обстоятельства свидетельствуют о важной роли коллагенов в возникновении и клиническом течении миопии у детском возрасте.

Многочисленные исследования выявляют прямую корреляцию между частотой развития миопии у родителей и детей, тем самым доказывая наличие фактора наследственной предрасположенности к миопии [Young T.L. et al., 2007; Dennis S.C. et al., 2008]. Поэтому в качестве генов, ассоциированных с развитием миопии, в первую очередь рассматриваются гены коллагенов и гены ферментов, участвующих в метаболизме коллагенов.

Важным аспектом лечения больных с миопией является оценка темпов её прогрессирования. При этом до сих пор не ясно, по какой причине миопия у некоторых детей останавливается на определенной степени, независимо от проводимого лечения и соблюдения гигиенических мероприятий. При этом до настоящего времени не разработаны какие-либо критерии прогнозирования клинического течения этого заболевания. Вместе с тем, они определяют тактику лечения таких детей: дальнейшее наблюдение либо переход к операциям склероукрепляющего типа.


Таким образом, одним из путей решения задачи разработки надежных критериев возникновения и оценки характера клинического течения миопии в настоящее время является поиск молекулярно-генетических маркеров метаболизма коллагенов. Выяснению этих обстоятельств и посвящена данная работа.
Цель исследования. Изучить генетические факторы риска развития и клинического течения осевой миопии у детей.
Задачи исследования:


  1. Определить основные эхобиометрические параметры глаз детей с миопией с учетом её степени и характера клинического течения, в сравнении с детьми с эмметропией.

  2. Изучить наследственный анамнез у детей с миопией разной степени, а также в группе сравнения и оценить его связь с эхобиометрическими параметрами глазного яблока.

  3. Исследовать полиморфизм генов COL1A1 (полиморфизм G-1997T и SpI), VDR (полиморфизм A-3731G, BsmI и TaqI), APOA1 (полиморфизм G-75A и С83Т) у детей с миопией разной степени и эмметропией.

  4. Изучить распределение исследованных аллелей и их сочетаний в зависимости от наследственного анамнеза и результатов инструментального исследования.

  5. Провести комплексную оценку результатов клинического, инструментального и лабораторного исследования в обследованных группах детей с разными темпами прогрессирования миопии.


Основные положения, выносимые на защиту:

  1. В группу риска по развитию миопии необходимо включать детей, имеющих родственников с миопией как первой, так и второй степеней родства.

  2. Изученные молекулярно-генетические факторы - полиморфизм генов COL1A1 (полиморфизм G-1997T и SpI), VDR (полиморфизм A-3731G, BsmI и TaqI), APOA1 (полиморфизм G-75A и С83Т) ассоциированы с особенностями течения миопии и наследственного анамнеза.
  3. Прогнозирование течения миопии у детей и подростков целесообразно проводить на основе комплексного клинико-функционального обследования с использованием результатов молекулярно-генетического исследования.




Научная новизна исследования.

Впервые изучена зависимость основных эхобиометрических параметров миопического глаза от особенностей наследственного анамнеза по миопии и установлено, что дети с отягощенным семейным анамнезом имеют более высокие значения глубины стекловидной камеры, по сравнению с детьми без отягощенного семейного анамнеза.

Впервые у детей с миопией осуществлено тестирование генов, кодирующих рецептор к витамину D и аполипопротеина АI, установлена частота аллелей и генотипов у детей, как с миопией разной степени, так и с эмметропией. Проведено тестирование гена, кодирующего α1-цепь коллагена I типа. Установлено, что вариант (-1997)Т по полиморфному сайту G-1997T гена COL1A1, вариант (-3731)А по полиморфному сайту A-3731G гена VDR, вариант bb/TT по полиморфному сайту BsmI/TaqI генa VDR и вариант (-75)А по полиморфному сайту G-75A гена APOA1 ассоциированы с развитием и прогрессированием миопии и определяют формирование длины переднезаднего отрезка глазного яблока, глубины передней и стекловидной камер глаза.
Практическая значимость.

В работе определён необходимый комплекс анамнестических и клинико-лабораторных исследований, позволяющих прогнозировать возможное развитие и прогрессирование миопии.

Доказано, что для повышения эффективности ранней диагностики предрасположенности к миопии необходимо внедрять анализ генетических маркеров, ответственных за регуляцию метаболизма коллагенов матрикса склеры глазного яблока. На основании выявленных клинико-генетических закономерностей формирования и развития миопии предложены критерии, позволяющие на ранних этапах и с учётом индивидуальных особенностей каждого ребёнка выявлять предрасположенность к нарушениям, характерным для осевой миопии, и формировать группы риска для своевременной организации профилактических мероприятий.
Апробация и внедрение результатов работы.

Основные материалы и положения диссертационной работы представлены и обсуждены на научно-практической конференции с Международным участием Европейского общества генетики человека (ESHG) (Амстердам, 2011) (Control No. 2011-A-1999-ESHG); на международной конференции European Human Genetics Conference (Вена, 2010); на международном конгрессе XX International Congress of Genetics (Берлин, 2008); на I Российском конгрессе с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины - возможное и реальное» (Санкт-Петербург, 2010); на научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные проблемы офтальмологии» (Москва, 2008); на детской секции Санкт-Петербургского научного медицинского общества офтальмологов (Санкт-Петербург, 2011); на Обществе медицинских генетиков Санкт-Петербурга (2011).


По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 2 - в изданиях, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста, содержит 27 таблиц и иллюстрирована 12 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы, общей характеристики материала и методов исследования, результатов исследования с их обсуждением, выводов, рекомендаций для практического здравоохранения и указателя литературы. Библиографический указатель содержит 131 источник литературы, из которых 33 - на русском и 98 - на иностранных языках.

Личный вклад автора в проведенное исследование.

Личное участие автора в получении научных результатов включало клиническое обследование больных, выполнение молекулярно-генетического тестирования, формирование базы данных, анализ и обобщение полученного материала.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объект и методы исследования.

Исследование выполнено на базе отделения микрохирургии глаза и лаборатории молекулярной диагностики с расширенной группой по экогенетике НИЦ ГБОУ ВПО СПбГПМА Минздравсоцразвития России.

Обследованы 114 детей (228 глаз): 72 девочки и 42 мальчика в возрасте 4-16 лет, у которых были собраны анамнестические данные, наследственный анамнез на наличие миопии у членов семьи первой и второй степеней родства.

В числе этих детей выделена группа из 84 пациентов (168 глаз), которым в дополнение к перечисленным методам обследования выполнено молекулярно-генетическое исследование: 58 девочек и 26 мальчиков 4-16 лет: 19 – с осевой миопией высокой, 44 – средней, 7 – слабой степени и 14 – с эмметропией.

Из исследования были исключены дети с гиперметропией, анизометропией, астигматизмом, а также пациенты, страдающие другой патологией органа зрения любого генеза.

Офтальмологическое обследование включало визометрию без коррекции и с оптимальной коррекцией по таблицам Сивцева или Орловой (с оптотипами в виде детских картинок), авторефрактометрию («Tomey TR-4000», Япония) и скиаскопию до и после циклоплегии (трехкратных инстилляций 1%- раствора циклопентолата гидрохлорида), бинокулометрию с помощью цветотеста (ЦТ-1) с расстояния 5м, аппланационную тонометрию по Маклакову, кинетическую периметрию с помощью настольного периметра с использованием порогового тестового объекта, эхобиометрию («Visante OCT», Германия) в режиме А-сканирования в координатах время-амплитуда, при которой оценивали длину переднезадней оси глазного яблока (ПЗО), глубину передней камеры (ПК), толщину хрусталика (ТХ) и глубину стекловидной камеры (ГСК) глаза. Последнее значение рассчитывали по формуле: ГСК = ПЗО-ПК-ТХ (мм).


Молекулярно-генетическое исследование включало тестирование полиморфизма G-1997T и SpI гена COL1A1, полиморфизма A-3731G, BsmI и TaqI гена VDR, полиморфизма G-75A и С+83Т гена APOA1. Полиморфизм G-1997T и SpI гена COL1A1, A-3731G и TaqI гена VDR определяли методом мультиплексной полимеразной цепной реакции с помощью набора реагентов «ОстеоГЕН-М» (ООО «ГЕН», Россия). Полиморфизм BsmI гена VDR - методом полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Выделения ДНК из лимфоцитов периферической проводили методом N.Blin, D.W.Stafford (1976). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили на автоматических термоциклерах «Терцик» («ДНК-технология», Россия) и «T3 Thermocycler» («Biometra», Германия) с использованием термостабильной рекомбинантной Taq ДНК-полимеразы («Сибэнзим» Россия; «Синтол» Россия). Определение полиморфного сайта методом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) рестриктазами фирм «Сибэнзим» (Россия) и «Fermentas» (Литва).

Для выполнения ПЦР использовали праймеры: F5’CAACCAAgACTACAAgTACCgCgTCagTgA3 и R5’AACCagggggAAgAggTCAaggg3’ (ЗАО «Синтол», Россия). Рестрикцию проводили с помощью эндонуклеазы PctI («Сибензим», Россия). Электрофоретическое разделение рестрикционных фрагментов осуществляли в 2% агарозном геле [Pani M. et al., 2000]. Полиморфизм G-75A и C+83T гена APOA1 определяли методом ПДРФ. Для ПЦР были выбраны следующие праймеры: F 5' Agg gAC AgA gCT gAT CCT TgA ACT CTT AAg 3' и R 5' TTA ggg gAC ACC TAg CCC TCA ggA AgA gCA 3' (ЗАО «Синтол», Россия). Рестрикцию проводили с помощью рестриктазы MspI («Сибэнзим», Россия) в течение 16 часов. После рестрикции фрагменты ДНК подвергали электрофоретическому разделению в 10% полиакриламидном геле [Heng С. et al., 2001].

Статистический анализ выполнен с использованием методов математической статистики, реализованных в пакетах Statistics ver.6.0. и SPSS ver. 13.0. Для анализа были использованы данные исследования и правого, и левого глаза каждого ребенка, при этом величины исследованных показателей между правым и левым глазом детей не достоверно не различались. Для анализа номинальных переменных - данных о частотах генотипов и аллелей по исследованным генам, использовали тест Хи-квадрат, точный критерий Фишера и критерий отношения рисков (ОР), или отношения преобладания, в зависимости от контекста [Флетчер Р. и др., 1998]. Для проверки гипотез относительно различия в подгруппах центральных параметров распределений (средних, медиан и других) непрерывных величин - эхобиометрических параметров глазного яблока, были использованы непараметрические методы: критерий Манна-Уитни и Крускала–Уоллиса. Для определения корреляции между количественными показателями использовали метод корреляции по Спирману.


Для комплексной оценки полученных данных и выявления маркеров миопии использован многофакторный анализ, с помощью которого построены модели межгрупповых различий, позволяющие выявить наиболее «весомые», информативные показатели, определяющие эти различия.

Результаты исследований и их обсуждение.

Результаты визометрии обследованных представлены в таблице 1.

Таблица 1

Характеристика остроты зрения обследованных детей

Клиническая рефракция

Пол

Число

Острота зрения без коррекции

Максимальная коррекция

Острота зрения с коррекцией

детей

Глаз

Миопия слабой степени

М

8

16

0.4 ± 0.05

1.75 ± 0.25

1.0 ± .0

Ж

13

26

0.45 ± 0.06

2.05 ± 0.37

0.89 ± 0.03

Миопия средней степени

М

15

30


0.12 ± 0.02

4.42 ± 0.29

0.79 ± 0.05

Ж

32

66

0.2 ± 0.01

4.28 ± 0.38

0.81 ± 0.03

Миопия высокой степени

М

5

10

0.06 ± 0.02

8.35 ± 0.68

0.76 ± 0.04

Ж

14

28

0.08 ± 0.01

8.16 ± 0.70

0.79 ± 0.04

Эмметропия

М

15

30

0.86 ± 0.01

-

1.0 ± .0

Ж

11

22

0.92 ± 0.02

-

1.0 ± .0

Установлено, что некорригированная острота зрения детей с миопией находится в обратной зависимости от степени тяжести миопии. На фоне максимальной оптической коррекции во всех сравниваемых группах (за исключением детей с миопией высокой степени) зафиксирована полная острота зрения. Не выявлено статистически значимых различий между группами обследованных мальчиков и девочек со сходной клинической рефракцией (p > 0.05).


Результаты ультразвукового обследования сравниваемых групп детей с миопией представлены в таблице 2.

Таблица 2

Некоторые эхобиометрические параметры глазного яблока обследованных детей


Клиническая рефракция

Число глаз

Длина ПЗО, мм

Глубина ПК, мм

Толщина хрусталика, мм

Глубина СК, мм

Миопия слабой степени

14

24,46 ± 0,19

3,47 ± 0,15

3,47 ± 0,04

17,64±0,31

Миопия средней степени

90

24,85 ± 0,08*

3,71 ± 0,04*

3,41 ± 0,03

17,76±0,12

Миопия высокой степени

38

25,93 ± 0,12*

3,53 ± 0,09

3,62 ± 0,05*

18,62±0,19*

Эмметропия (контроль)

14

23,82 ± 0,17

3,38 ± 0,07

3,38 ± 0,11

17,16±0,2

*/ Различия по сравнению с контрольной группой статистически значимы: p<0,001.

У всех детей с осевой миопией зафиксированы значения длины переднезаднего отрезка глазного яблока, пропорциональные степени миопии. При этом они различались при сравнении соответствующих величин в группах обследованных с миопией высокой степени и эмметропией (p<0,001), а также с миопией средней степени и эмметропией (р<0,001). Также статистически значимые различия были выявлены при сравнении соответствующих величин в группах детей с миопией высокой и слабой степени (p<0,001). Значения глубины передней камеры в сравниваемых группах были пропорциональны степени миопии. В частности, выявлены статистически значимые между величинами рассматриваемого показателя у детей с миопией средней степени и в контрольной группе (р<0,001), а также у детей с миопией высокой степени (р=0,002).


Толщина хрусталика оказалась максимальной у детей с миопией высокой степени, достоверно превышая соответствующие показатели во всех сравниваемых группах (р<0,001). По величинам данного параметра группы обследованных с миопией средней, слабой степени и эмметропией не различались.

При сравнении глубины стекловидной камеры, в зависимости от выраженности миопии, обнаружены значимые различия соответствующих величин у детей с миопией высокой степени и эмметропией (p<0,001), а также с миопией средней степени и эмметропией (р=0,036). Также значимые различия выявлены между группами детей с миопией высокой и средней степени (p<0,001). В целом, максимальные значения исследованных эхобиометрических показателей (переднезадний размер глазного яблока, глубина стекловидной камеры и толщина хрусталика) обнаружены у детей с миопией высокой степени.

Установлена положительная корреляция (разной силы) переднезаднего размера глазного яблока и глубины передней камеры во всех исследованных группах: r=0,699; p=0,020 – с миопией высокой; r=0,351; p=0,031 – средней степени и r=0,539; р=0,015 – эмметропией и миопией слабой степени. Аналогичная зависимость обнаружена между длиной ПЗО и глубиной стекловидной камеры: r=0,834; p<0,001 – при миопии высокой; r=0,920; p<0,001 – средней степени и r=0,580; р=0,013 – при эмметропии и миопии слабой степени. Таким образом, глубина передней и стекловидной камер коррелирует с длиной переднезаднего отрезка глазного яблока у детей с миопией всех степеней.



следующая страница >>