reforef.ru 1

Методология, задачи и принципы аллергодиагностики in vitro

Ю.А. Митин, д.м.н., Военно-медицинская академия,  г. Санкт-Петербург

Возможности всех лабораторных методов, в том числе и методов аллергодиагностики in vitro, ограничены тем, что при исследовании врачи-лаборанты имеют дело не с целостным человеческим организмом, а только с его тканями (лимфа, кровь, моча и т.д.). Кроме того, применяемые в аллергодиагностике лабораторные методы не обладают возможностями выявления морфологических изменений тканей так, как это, например, могут сделать некоторые другие методы исследований (рентгенологический, ультразвуковой и т.п.), а также определения целого ряда функциональных характеристик тканей и органов (электрофизиологической деятельности сердца как при исследовании ЭКГ, реоэнцефалографических характеристик как при изучении РЭГ и т.д.).

Формулируя заключение, написанное на основании данных аллергологического лабораторного обследования, врач-лаборант, по сути дела, формулирует лабораторную часть общего диагноза аллергического заболевания. Этот лабораторный фрагмент диагноза используется клиницистом при установлении полноценного диагноза аллергического заболевания, в том числе степени его тяжести и характера течения, основанного на данных анамнеза, клиники, специальных, лабораторных и дополнительных методов исследований.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРИНЦИПОВ И ЗАДАЧ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Установление этиологии аллергического заболевания, как известно, состоит в выявлении конкретных причин — аллергенов, вызывающих развитие симптомов болезни. Формулируя современное определение аллергена и сенсибилизации, можно сказать, что аллерген — сложное вещество, обладающее эпитопом, критической молекулярной массой, иммунный ответ на которое реализуется сенсибилизацией или аллергической реакцией, а сенсибилизация — специфическая измененная реактивность иммунной системы, обусловленная наличием аллерген-специфических антител и аллерген-специфических лимфоцитов, также появлением и ростом представительства рецепторов различной аффинности для связывания аллерген-специфических антител в органах и тканях (Митин Ю.А., 2005).


Лабораторная диагностика аллергических заболеваний должна помочь клиницисту в установлении этиологии заболевания, его патогенетической характеристики, включая характер и степень нарушений иммунной и других систем организма. Поэтому основными задачами лабораторной диагностики аллергического заболевания являются:

•    установление сенсибилизации к аллергенам (специфическая аллергодиагностика);

•    определение типа (типов) аллергической реакции (специфическая аллергодиагностика);

•    выявление характера и степени иммунных нарушений (иммунодиагностика);

•    характеристика патогенетических изменений, типичных для данного аллергического заболевания (клиническая лабораторная диагностика).
Таким образом, установление сенсибилизации к аллергенам и типа (типов) аллергической реакции является целью специфической аллергологической диагностики.

Этиологическая диагностика включает в себя выявление не только сенсибилизации к отдельным аллергенам, типа (типов) аллергической реакции, но, главным образом, установление их роли в развитии данного аллергического заболевания. Использование специфических методов лабораторной диагностики аллергии показано:

•    для подтверждения наличия сенсибилизации;

•    для выявления скрытой (субклинической) сенсибилизации;

•    при наличии противопоказаний к проведению кожных проб (обострение основного заболевания; в период развития острых инфекционных, нервных и психических заболеваний; в случае возникновения декомпенсированных состояний болезней сердца, печени, почек и системы крови; вскоре после острой аллергической реакции; в период лечения гормонами);

•    во всех случаях, когда показана реакция Прауснитца — Кюстнера, но нет реципиента или имеется опасность заражения реципиента инфекционным заболеванием, имеющимся у донора;

•    в случаях необходимости дифференциальной диагностики положительных/ложноположительных или отрицательных/ложноотрицательных результатов, полученных при кожном тестировании. Принципы лабораторной диагностики аллергических заболеваний:

1. Ведущая роль лечащего врача в тандеме клиницист — лаборант.


Диагностика аллергического заболевания включает 2 этапа: клинический и лабораторный. Прежде чем определить конкретный лабораторный метод специфической аллергологической диагностики, необходимо выявить особенности иммунологического механизма реализации аллергической реакции у пациента. Для этой цели врач-аллерголог анализирует анамнез, клинические проявления заболевания в прошлом и настоящем, с целью определения крута предполагаемых аллергенов и типа иммунологического реакций. Выявляя клинические симптомы или синдромы, он относит их к определенному типу аллергических реакций, участники которой (например, Ig E специфический при аллергических реакциях 1 типа), должны быть установлены лабораторными методами. Существующие лабораторные методы выявляют только состояние сенсибилизации, то есть свидетельствуют об измененной реакции иммунной системы больного на конкретный аллерген. Поскольку они характеризуют только иммунные нарушения, а не реакцию всего организма, результаты лабораторной диагностики не могут служить единственным доказательством того, что именно данный аллерген является этиологическим агентом аллергического заболевания.

Поэтому в тандеме клиницист — лаборант специалистом, определяющим объем и необходимость определенных методов исследования, является клиницист — он, иными словами, определяет стратегию диагностики.

2. Приоритет клинического этапа (объем и методы лабораторных исследований определяются на этапе клинического обследования).

При планировании лабораторной диагностики и необходимости каких-то специфических методов исследования необходимо учитывать различия в иммунологических механизмах и участниках различных типов аллергических реакций, так как большинство лабораторных методов дает информацию лишь относительно конкретных участников иммунного реагирования (например, выявлять специфические антитела классов Ig G или Ig M при 2 типе аллергических реакций, а также сенсибилизированные лимфоциты при 4 типе аллергических реакций). Таким образом, предположение о патогенетических механизмах аллергического заболевания может оказать влияние на выбор определенных методов исследования, диктует необходимость применения адекватных патогенезу методов, т.е. обосновывает 3 принцип.

3. Патогенетическая адекватность (соответствие используемых методов лабораторных исследований патогенезу изучаемых реакций).  


Иммунологические тесты в аллергодиагностике условно могут быть разделены на 2 большие группы:

1)  неспецифические (направленные на выявление общих изменений иммунной системы при аллергии); 2)  специфические (выявление участвующих в иммунологической фазе аллергической реакции антител и клеток).
Специфическая аллергологическая диагностика in vitro включает 2 основных типа тестов: выявляющие антитела (прямым или косвенным способом) или сенсибилизированные к аллергену лимфоциты. Существующие иммунологические методы специфической аллергологической диагностики выявляют состояние сенсибилизации, то есть свидетельствуют об измененной реакции только иммунной системы на конкретный аллерген, однако еще не могут служить единственным доказательством того, что именно данный аллерген вызывает аллергическую реакцию, для которой характерно наличие реакции нескольких тканей или аллергическое заболевание, для которого необходимо наличие реакции целого организма.

Таким образом, для полноценной характеристики изменений только одной (иммунной) системы необходим целый ряд дополнительных исследований, кроме выявления сенсибилизации и вызывающего ее аллергена. Поэтому для более полноценной характеристики специфических и неспецифических изменений иммунной системы необходимо реализовать 4 принцип.

4. Сочетание специфических и неспецифических методов иммунодиагностики.

 При дифференциальной диагностике аллергических и неаллергических (псевдоаллергических) заболеваний необходимо выяснение участия иммунологических механизмов (иммунопатогенеза) в их реализации. Известно, что аллергические и псевдоаллергические процессы различаются, главным образом, наличием (при аллергии) или отсутствием (при псевдоаллергии) иммунологической (первой) фазы аллергической реакции. Поскольку 2 другие фазы — патохимическая и патофизиологическая — у данных процессов общие, то можно сформулировать еще один важный принцип дифференциальной диагностики аллергии и псевдоаллергии.

5. Установление неиммунологических (псевдоаллергических) механизмов заболевания путем исключения иммунологических.


С этой целью используются методы изучения иммунопатогенеза аллергии, определяющие возможных участников иммунологической фазы, например, определение специфических антител IgE класса при реакциях 1 типа или сенсибилизированных лимфоцитов при реакциях 4 типа. Только отрицательный ответ таких исследований позволяет утверждать, что реакция или заболевание носит псевдоаллергический характер.

6. Стандартность методик, наличие контроля качества лабораторных исследований.


Критерии, которыми характеризуются различные виды лабораторной диагностики, могут быть связаны с оценкой различных составляющих их эффективности: аналитической, экономической и диагностической. Под аналитической характеристикой понимается минимально определяемое методом количество вещества. Экономическая характеристика связана с оценкой стоимости 1 исследования. Диагностический подход связан с оценкой лабораторных исследований, в основе которой лежит распределение результатов исследований на истинные и ложные. В качестве метода, используемого для оценки результатов, используется понятие безупречного «золотого стандарта», т.е. какой-то метод признается эталоном, по которому сравниваются другие методы.

Все результаты исследований: у больных могут быть истинноположительными (ИП) и ложноотрицательными (ЛО), у здоровых — истинноотрицательными (ИО) и ложноположительными (ЛП). Для лабораторных тестов при этом подходе выделяются такие показатели, как:

Диагностическая чувствительность (Se, sensitivity). Представляет собой процентное отношение частоты истинноположительных результатов теста у больных данной болезнью к сумме истинноположительных и ложноотрицательных результатов или, другими словами, как доля больных, у которых выявляется положительный результат, или как частота положительного результата теста у больных:

Se = (PS/S)x100%, где PS — истинно положительные, S — число больных.


Диагностическая специфичность (Sp, specificity) — это процентное отношение истинноотрицательных результатов у лиц, не страдающих болезнью (здоровых), к сумме истинноотрицательных результатов (то есть вероятность отрицательного теста при отсутствии болезни), иными словами, это частота отрицательного результата теста, получаемая у здоровых лиц:

Sp = (NH/H)x100%, где NH — истинно отрицательный результат теста, а Н — число здоровых лиц.

Диагностическая эффективность (DE) — это процентное отношение истинных, то есть соответствующих состоянию обследуемых пациентов результатов теста, к общему числу полученных результатов, или доля истинных результатов в общем числе исследований:

DE = (PS+NH)n, где PS — число истинноположительных случаев, NH — число истинноотрицательных случаев, a n — число исследований.

В общем виде кривые специфичности и чувствительности при определении какого-нибудь количественного параметра находятся в определенной зависимости (больше — меньше). Важную роль играет определение точки разделения — уровня регистрации положительного результата. При этом, чтобы установить точку разделения с учетом последствий ложных решений, используется ROC-кривая (relative operating characteristic), т.е. кривая взаимной зависимости вероятностей ложноположительных и ложноотрицательных результатов. При использовании данной кривой справедливо следующее положение: сдвиг точки разделения при определении к низким концентрациям, повышает чувствительность (выявляется большее число больных), но параллельно растет число ложноположительных результатов. Поэтому использование ее построено на выборе точки разделения на основе оценки «пользы» и «вреда» от соотношения истинных и ложных решений (больше положительных — больше ложноположительных, больше отрицательных — больше ложноотрицательных). К сожалению аллергологов, на сегодняшний день пока не найден идеальный, признанный всеми метод, который позволял бы в 100% случаев выявлять истинную сенсибилизацию — без ложноположительных или ложноотрицательных результатов, полностью коррелируя с результатами клинической диагностики.


Итогом всего диагностического процесса является оценка данных лабораторных исследований с клинических позиций — клинико-иммунологическая трактовка результатов лабораторных исследований.

Для оценки изменений иммунной системы требуются специальные (иммунологические) лабораторные методы. Распознавание аллергена и последующая аллергическая реакция вызывают активацию иммунной системы. Для выявления степени такой активации проводятся лабораторные исследования, позволяющие оценить изменения морфологии и функций различных звеньев иммунной системы. С этой целью используются тесты для определения субпопуляций Т- и В-лимфоцитов, уровня иммуноглобулинов, комплемента, циркулирующих иммунных комплексов, медиаторов аллергического воспаления и цитокинов, в большей степени участвующих в иммунном ответе на аллергены: IL-4 (активация продукции IgE), IL-10, IL-5, гамма-интерферона и других. Через 6-18 часов после реакции с аллергеном на сенсибилизированных лимфоцитах усиливается экспрессия рецепторов к IL-2, уровень которой можно оценить с помощью моноклональных антител к CD25-антигену. С этой же целью можно определять наличие на лимфоцитах других молекул активации — CD69, CD71. Известно, что при стимуляции лимфоцитов аллергенами усиливается выделение IL-5, IL-4, гамма-интерферона, но не IL-2 и фактора некроза опухолей-альфа. Аллергические заболевания могут сопровождаться изменениями картины периферической крови и белковых фракций. Часто наблюдаются лимфоцитоз, возрастание содержания белковых фракций, снижение уровня тромбоцитов и альбуминов. Кроме этого может происходить повышение СОЭ, содержания лейкоцитов и эозинофилов.

Типичные изменения иммунной системы, которые возникают при аллергических реакциях и заболеваниях:


•    снижение абсолютного и относительного уровня Т-клеток (фенотип CD3+CD8+);

•    изменение количества Т-хелперов (фенотипCD3+CD4+);

•    повышение уровня активированных Т-лимфоцитов (HLA-DR+, CD25+);

•    изменение уровня цитокинов — повышение концентрации ИЛ-4 и ИЛ-5, снижение содержания гамма-интерферона;

•    повышение уровней IgG, IgM, общего IgE;

•    снижение фагоцитарной активности нейтрофильных лейкоцитов;

•    повышение уровня катионного белка эозинофилов; •    повышение уровня ЦИК.

Наиболее часто в клинической практике используется изучение уровней общего и аллергенспецифического иммуноглобулина Е. Остановимся на трактовке данных исследований.

Особенности интерпретации исследований общего IgE.



1.            Повышение уровня общего IgE может быть вызвано не только атопией, а целым рядом других заболеваний, в т.ч. глистными инвазиями, иммунодефицитами, бронхопульмональным аспергиллезом и др.

2.            Нормальный уровень общего IgE в сыворотке крови не отрицает наличия сенсибилизации. Примерно у трети больных атопическими заболеваниями уровень общегоIgE может находиться в пределах нормы (30-100 кЕ/л).

3.                    При сенсибилизации к одному (нескольким) аллергенам содержание общего IgE может быть в пределах нормы, а специфического IgE — повышено.

4.                    Концентрация общего IgE в сыворотке крови может быть в пределах нормы при неатопических состояниях   неиммунной природы хронической рецидивирующей крапивнице и ангионевротическом отеке.

5.            Верхняя граница нормы общего IgE (100 кЕ/л) у представителей зон, эндемичных по гельминтозам, может быть выше обычной.

6.            Обнаружение аллергенспецифического IgE (к какому-либо аллергену или антигену) выявляет только сенсибилизацию и еще не доказывает, что именно этот аллерген является причиной аллергического заболевания.

Особенности интерпретации исследований специфических IgE.

1.                   Отрицательный результат исследований на специфический IgE может быть обусловлен стратегией скрининга (отсутствовал тест на этот аллерген). Отсутствие специфического IgE в сыворотке периферической крови не исключает возможности участия в патогенезе IgE-зависимого механизма аллергической реакции, так как возможен местный синтез IgE, или связывания синтезированного IgE тканями, что может происходить без изменения концентрации специфического IgE в периферической крови.


2.          Антитела других классов, особенно IgG (IgG4), специфичные к аллергену, в определенных случаях могут быть причиной ложноотрицательных результатов.

3.          Высокий уровень аллергенспецифического иммуноглобулина Е характеризует наличие высокого уровня сенсибилизации только по отношению к конкретному изучаемому аллергену.

4.          При высоких концентрациях общего IgE чаще могут возникать ложноположительные результаты исследований на специфические IgE, т.к. в таких условиях повышается вероятность связывания неспецифических IgE с аллергеном.

5.          Идентичные количественные результаты определения специфического IgE для разных аллергенов не означают их одинакового клинического значения.

6.          Окончательное заключение и интерпретация лабораторных данных должны быть сделаны специалистом-аллергологом на основании сопоставления результатов лабораторных исследований с клинической картиной и данными аллергологического анамнеза.
В заключение еще раз можно напомнить главные преимущества методов иммуноанализа, применяемых в аллергологии:

•    безопасность для пациента;

•    отсутствие противопоказаний;

•    возможность проведения исследований в любом, в том числе раннем детском возрасте, в периоде обострения, при высокой степени сенсибилизации;

•    выявление реакции на большое число аллергенов за 1 исследование;

•    отсутствие влияния измененной реактивности кожи;

•    исследование возможно на фоне лечения.

ЛИТЕРАТУРА


1.        Аллергические болезни: диагностика и лечение: Пер. с англ. Под ред. Чучалина А.Г., Гущина И.С, Улумбекова Э.Г., Фассахова Р.С. — М.: ГЭОТАР Медицина, 2000. -768 с.  

2.        Гущин И.С. Аллергическое воспаление и его фармакологический контроль. — М.:Фармакус Принт, 1998. — 252 с.

3.   Драник Г.Н. Клиническая иммунология и аллергология. — М: ООО «Медицинское информационное агентство», 2003. — 604с.


4.        Клиническая иммунология и аллергология. Под ред. А.В.Караулова — М.: Медицинское информационноеагентство, 2002.-651 с.

5.        Клиническая иммунология и аллергология. Под ред. Лолора-младшего, Т. Фишера, и Д. Адельмана. Пер. с англ. — М, Практика, 2000. — 806 с.

6.        Новые определения некоторых ключевых терминов аллергологии. Аллергология. — Санкт-Петербург. — 2005. — № 3. — С. 57-6

7.        Общая аллергология Т1. Под ред. Г.Б.Федосеева. — Санкт-Петербург: «Нормед-Издат»-2001.-816 с.

8.        Ривкин В.Л. Медицинский толковый словарь. — М.: «Медпрактика-М», 2002. — 236 с.

9.        Фрадкин В.А. Диагностические и лечебные аллергены. — М.: Медицина, 1990. -256 с.

10.     Хаитов P.M., Игнатьева ГА., Сидорович И.Г. Иммунология. М.: Медицина, 2000. -432 с. 11.  Частная аллергология. Т1. Под ред. Г.Б.Федосеева. — Санкт-Петербург: «Нормед-Издат»,-2001.-464с.