reforef.ru 1

Кириленко В.П., Воскресенский С.Л.

БИОХИМИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ В ШЕЙКЕ МАТКИ НА ПРОТЯЖЕНИИ БЕРЕМЕННОСТИ И РОДОВ.
«Государственное учреждение образования «Белорусская медицинская академия последипломного образования»
Резюме. В статье изложены результаты изменения содержания гликозаминогликанов, белково-углеводных комплексов, активности лизосомальных ферментов в цервикальной слизи и сыворотке крови у беременных женщин с физиологическим течением гестации в первом, втором, третьем триместре, накануне родов и в родах. Установлено, что с наступлением беременности происходила значительная интенсификация метаболических процессов в соединительной ткани шейки матки. Накануне родов активность исследуемых компонентов значительно возрастала, по сравнению с предшествовавшим неделям гестации. Во время родов существенных биохимических трансформаций в основном веществе цервикального матрикса шейки матки не происходило.

Ключевые слова: физиологическая беременность, цервикальная слизь, сыворотка крови, полисахариды, лизосомальные ферменты, шейка матки.
Введение

Основная функция шейки матки – удержание беременности. В отличие от тела, состоящего из миометрия, строма шейки матки образована соединительной тканью, которая состоит из клеточных и внеклеточ­ных элементов. Последние представлены колла­геновыми. эластиновыми волокнами и межуточным веществом. Коллагеновые во­локна образуют каркас, скрепленный специальными связочными эластиновыми фиб­риллами, а свободные промежутки заполнены адгезивным вещест­вом, в котором находятся клетки. [3].

Важнейшими структурными компонентами межклеточного вещества, являются гликозаминогликаны и их фракции, а также белково-углеводные комплексы и их составляющие гексозы гликопротеинов и гликозаминогликанов. Они характеризуют прочность, эластичность шейки матки. А ферменты, участвующие в их метаболизме, в частности, кислые катепсины, β-d-гликозидазы, гиалуронидазы отражают его интенсивность [2, 4].

Цель исследования – установить изменение содержания гликозаминогликанов, белково-углеводных комплексов и активность ферментов у женщин во время физиологической беременности, накануне родов и в родах.

Материалы и методы

Выполнение данной работы включало исследование гликозаминогликанов и их фракций, белково-углеводных комплексов (общих гексоз, гексоз гликозаминогликанов и гликопротеинов), активность лизосомальных ферментов (кислых катепсинов, β-d-гликозидазы, гиалуронидазы) в сыворотке крови и цервикальной слизи у небеременных, на протяжении беременности, неосложненной угрозой прерывания, и рожениц.

В цервикальной слизи данные компоненты исследованы у 74 женщин, из которых небеременных было 10, беременных в сроке гестации 7 – 13 недель – 10; 14 – 27 недель – 16; 28 – 37 недель – 16; 38 – 40 недель – 10, рожениц - 12.

Исследование в сыворотке крови проведено у 85 пациенток в тех же группах.

Содержание гликозаминогликанов в сыворотке крови и цервикальной слизи определяли методом Greiling H [10], основанном на взаимодействии ГАГ с резохином, при котором образуются преципитаты, вызывающие потерю прозрачности раствора. Степень помутнения пробы оценивали нефелометрически. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре «Солар» PV -2151 CC при длине волны 400 нм, синий светофильтр, в кювете с длиной оптического слоя 1 см.

Общие гликозаминогликаны разделяли на фракции с помощью 1 М раствора NaCl, используя их свойство к диссоциации в солевом растворе. Первой фракцией при этом был - хондроитинсульфат C, второй - хондроитинсульфаты A+B, третьей - кератансульфат, гепарансульфат, гепарин [6].

Определение гликозаминогликанов в цервикальной слизи проводили по той же методике, что и в сыворотке крови, но с учетом неодинакового количества слизи в каждой пробе и высокой вязкости среды. В частности, перед исследованием каждую пробу слизи взвешивали для последующей стандартизации полученных результатов. Затем разводили физиологическим раствором (1:4), растирали до однородной консистенции, термостатировали при Т - 37°С в течение 60 минут.

Гиалуронидазную активность исследовали методом Шараева П.Н. и соавт. [7]. В основе метода лежит определение продуктов взаимодействия субстрата с карбазольным реактивом, которое проявляется фиолетово-розовым окрашиванием. Его оценивали с помощью спектрофотометра «Солар» PV -2151 CC при длине волны 530 нм и зеленом светофильтре. По разности оптических плотностей опытной и контрольной проб, с использованием калибровочной кривой, находили количество продуктов гидролиза гиалуроновой кислоты. Гиалуронидазную активность выражали в микромолях глюкуроновой кислоты на 1 литр сыворотки крови за 1 час инкубации (мкмоль/л•ч), а для цервикальной слизи в нмоль/мг слизи•ч.


Кислые катепсины определяли методом Anson в модификации Покровского А.А., Арчакова А.И. [8]. Методика основана на особенностях взаимодействия этих ферментов с гемоглобином крупного рогатого скота, выделенного из крови с использованием специальных технологий. Кислые катепсины расщепляют гемоглобин до кислоторастворимых пептидных фрагментов, количество которых определяют с помощью спектрофотометра СС – 46 при длине волны 280 нм.

Активность -d-глюкозидазы определяли по методике Anson, в модификации Юсиповой Н.А. [9]. Метод основан на определении количества O – или n – нитрофенола, ферментативно освобожденного из субстратов β-d-гликозидазой при определенных условиях. За единицу активности фермента принимали такую, которая в стандартных условиях опыта в течение часа приводила к появлению 1 мкг n-или о-нитрофенола. Результат оценивали на спектрофотометре СС – 46 при длине волны 400 нм.

Метод определения гексоз, входящих в состав гликозаминогликанов (Г-ГАГ) и гликопротеинов (Г-ГП), разработан И.В. Неверовым и Н.И. Титоренко. Он основан на взаимодействии Г-ГАГ с цетилперидинийхлоридом, а Г-ГП - с орциновым реактивом. Количественная оценка производилась с помощью колориметрии на спектрофотометре «Солар» PV -2151 CC с зеленым светофильтром при длине 540 нм, в кювете с длиной оптического слоя 1 см. В качестве контроля использовали пробы, содержавшие 1 мл раствора едкого натра и 8,5 мл орцинового реактива [5].

Статистическая обработка результатов исследования осуществлялась пакетом прикладных программ Statistica 6.0. Проверка гипотез о равенстве двух средних производилась с помощью критерия Стьюдента (t), с использованием непараметрического критерия Хи – квадрат (χ²). Различия между данными считались достоверными при p<0,05 [1].
Результаты исследования

Содержание общих гликозаминогликанов и их фракций в цервикальной слизи определено у 74 пациенток. I фракция отражала концентрацию хондроитинсульфата C, II - хондроитинсульфатов A+B, III - кератансульфата, гепарансульфата, гепарина.


Уровень общих гликозаминогликанов у небеременных был 1,9±0,09 мкг ГАГ/мг (таблица 1).

С наступлением беременности он увеличился в три раза. После некоторого снижения во втором триместре он вновь стал возрастать и к сроку родов (38 – 40 недель) достиг максимума 14,8±0,16 мкг ГАГ/мг слизи, что в 7 раз превысило их уровень у небеременных. В родах содержание общих ГАГ резко снижалось и достигало минимума – 3,5±0,12 мкг ГАГ/мг слизи по отношению ко всем периодам гестации.Содержание в цервикальной слизи хондроитинсульфата С (І- фракция ГАГ), хондроитинсульфата А+В (ІІ-фракции), кератансульфата, гепарансульфата и гепарина – (ІІІ-фракция) на протяжении беременности изменялись аналогично. Различия с общими ГАГ носили лишь количественные выражения, а сама динамика была одинаковой – резкое повышение с началом беременности, снижение во втором триместре с последующим ростом в третьем, пиком их концентрации накануне завершения беременности и спадом во время родов, (таблица 3.1).
Таблица 1. — Содержание ГАГ в цервикальной слизи во время беременности, мкг ГАГ/мг слизи, (М±m)


Категории

обследованных

n

Общие ГАГ

І фракция

ІІ фракция

ІІІ фракция

Небеременные

10

1,9±0,09○○

1,0±0,11○○

0,5±0,03○○

0,4±0,01○○

Беременные
















7 – 13 нед.

10

6,7±0,21○*

2,3±0,09○*

2,5±0,10○*

1,9±0,11○*

14 – 27 нед.

16

4,0±0,05*

1,4±0,03*

1,4±0,01*

1,2±0,01*

28 – 37 нед.

16

10,1±0,13*

3,0±0,1*

4,1±0,09*

3,0±0,07*

38 – 40 нед.

10

14,8±0,16**

4,5±0,14**

5,6±0,06**

4,7±0,06**

Роженицы

12

3,5±0,12*

1,7±0,1*

1,0±0,05*

0,8±0,03*

Примечание — различия между ○○ и, а также ** и * достоверны, р<0,05.

Содержание общих ГАГ и их фракций в сыворотке крови у небеременных пациенток было 299±12,4 мг/л (таблица 1).


С наступлением и течением беременности их концентрация в І, ІІ и ІІІ триместре изменялась незначительно (р>0,05). Накануне родов она несколько увеличилась, а в родах снова уменьшилась (таблица 2).

Таблица 2. — Содержание общих гликозаминогликанов и их фракций в сыворотке крови во время беременности, мг/л, (М±m)

Категории

обследованных

n

Общие ГАГ

І- фракция

ІІ- фракция

ІІІ- фракция

Небеременные

15

299±12,4

90±8,2○○

41±5,3○○

169±14,3○○

Беременные
















7–13 нед.

11

300±25,3*

134±14,1○*

83±11,1○*

83±7,1○*

14–27 нед.

17

274±10,3*


115±5,9*

71±5,2*

88±10,5*

28–37 нед.

16

331±25,0*

159±14,3*

106±11,7*

66±6,9*

38-40 нед.

11

464±35,3*

244±23,0**

153±11,1**

67±7,2*

Роженицы

15

401±21,3*

195±15,2*

124±9,3*

92±6,8*

Примечание — различия между ○○ и, а также ** и * достоверны, р<0,05.
І и ІІ фракции ГАГ изменялась синхронно. С наступлением беременности их концентрация возрастала по сравнению с небеременными, во ІІ триместре несколько снижалась и существенно увеличивалась накануне родов, значительно превышая уровни у небеременных и в І триместре. Сами роды сопровождались хотя и достаточно высоким по отношению к беременным уровнем І и ІІ фракции, но существенно (р<0,05) более низким, чем он был в конце беременности.

Содержание ІІІ – фракции ГАГ (кератансульфат, гепарансульфат и гепарин) в сыворотке крови с наступлением и прогрессированием беременности снижалось. К сроку окончания беременности, в противоположность уровню І и ІІ фракции во время родов он увеличивался.


Содержание общих гексоз, гексоз гликозаминогликанов (гексозы ГАГ) и гексоз гликопротеинов (гексозы ГП) в цервикальной слизи определено у 74 женщин.

Содержание общих гексоз в цервикальной слизи у небеременных было 45,0±2,20 мкг ГАГ/мг слизи. В первом триместре физиологической беременности оно, по сравнению с небеременными женщинами, существенно (р<0,05) снижалось, но в дальнейшем к сроку родов увеличивалось и достигало своего максимума 28,0±0,62 мкг ГАГ/мг слизи. Однако их уровень все равно был существенно ниже, чем у небеременных. Сам процесс родов сопровождался низкой концентрацией общих гексоз, сопоставимой с таковой при беременности до 38 недель – 8,5±0,21 мкг ГАГ/мг (таблица 3).
Таблица 3. — Содержание гексоз в цервикальной слизи во время беременности, мкг ГАГ/мг слизи, (М±m)


Категории

обследованных

n

Общие гексозы

Гексозы ГАГ

Гексозы ГП

Небеременные

10

45,0±2,20○○

25,2±1,51○○

19,8±2,07○○

Беременные













7 – 13 нед.

10

6,4±0,14○*

1,8±0,13○*

4,6±0,15○*

14 – 27 нед.


16

11,7±0,31*

1,8±0,06*

9,9±0,34*

28 – 37 нед.

16

10,7±0,30*

0,9±0,09*

9,8±0,33*

38 – 40 нед.

10

28,0±0,62**

2,2±0,09**

25,8±0,56**

Роженицы

12

8,5±0,21*

0,6±0,07*

7,9±0,25*

Примечание — различия между ○○ и, а также ** и * достоверны, р<0,05.

Изменение содержания гексоз ГАГ и гексоз ГП подчинялись тем же закономерностям, что и общих гексоз. С наступлением беременности их концентрация резко падала, но ко времени ее окончания вновь увеличивалась. Роды протекали на уровнях гексоз близких к минимальным в период гестации (таблица 3).

Различия в динамике содержания гексоз ГАГ и гексоз ГП относились не к направленности их изменений, а к количественным отношениям. Так, например, численные значения изменения уровня гексоз ГП с наступлением беременности менялись меньше, чем у гексоз ГАГ, но предродовой пик был, более значим у первых. Течение беременности сопровождалось снижением уровня гексоз ГАГ в ІІІ триместре, а гексоз ГП сохранением прежних значений. Предродовой пик гексоз ГАГ хоть и был, но его численные значения были достоверно (р<0,05) меньше чем таковые, у небеременных. В то же время содержание гексоз ГП накануне родов превышало (р<0,05) их уровень у небеременных (таблица 3).


Содержание общих гексоз, гексоз ГАГ, гексоз ГП в сыворотке крови у небеременных и беременных женщин на протяжении беременности, накануне родов в 38 – 40 недель, в родах достоверно не изменялось (таблица 4). Все колебания значений находились в пределах статистических погрешностей.
Таблица 4. — Содержание гексоз в сыворотке крови во время беременности, г/л, (М±m)


Категории

обследованных

n

Общие гексозы

Гексозы ГАГ

Гексозы ПГ

Небеременные

15

0,9±0,03

0,4±0,05

0,5±0,06

Беременные













7 – 13 нед.

13

1,0±0,10

0,5±0,09

0,5±0,09

14 – 27 нед.

17

1,0±0,07

0,4±0,03

0,6±0,08

28 – 37 нед.

15

1,0±0,03

0,5±0,04

0,5±0,05

38 – 40 нед.


11

1,2±0,05

0,6±0,05

0,6±0,08

Роженицы

17

1,0±0,07

0,4±0,04

0,6±0,09

Примечание - достоверных различий в динамике исследованных параметров нет р>0,05.
Активность кислых катепсинов в цервикальной слизи у небеременных была 0,01±0,001 нмоль/мг слизи•ч.

С наступлением беременности она резко увеличилась в (10 раз), во ІІ и ІІІ триместре снижалась, но оставалась более высокой, чем до беременности (р<0,05). К сроку родов отмечался всплеск активности. В этот период она превышала таковую почти в 40 раз, по сравнению с небеременными и в 4 раза по отношению к первым неделям гестации (таблица 5).

Изменение активности β-d-гликозидазы и гиалуронидазы в цервикальной слизи у небеременных и беременных женщин носило аналогичный характер (таблица 5). С наступлением беременности активность ферментов увеличивалась (р<0,05) для первых в 20 раз, а для вторых - в 4 раза. Течение беременности сопровождалось либо стабильным уровнем показателей, либо их незначительным снижением, но накануне родов отмечался резкий всплеск активности ферментов (р<0,05). Сам же процесс родов происходил на уровнях присущих началу развития беременности (р>0,05).
Таблица 5. — Активность ферментов в цервикальной слизи во время беременности, нмоль/мг слизи•ч, (М±m)

Категории

обследованных

n

Кислые катепсины

β-D-гликозидаза


Гиалуронидаза

Небеременные

10

0,01±0,001○○

0,06±0,002○○

1,1±0,05○○

Беременные













7 – 13 нед.

10

0,10±0,003○*

0,14±0,004○*

4,1±0,18○*

14 – 27 нед.

16

0,05±0,001*

0,14±0,002*

1,4±0,04*

28 – 37 нед.

16

0,06±0,001*

0,16±0,003*

1,6±0,06*

38 – 40 нед.

10

0,39±0,006**

0,53±0,011**

6,6±0,21**

Роженицы

12

0,05±0,001*

0,14±0,002*

3,6±0,06*


Примечание — различия между ○○ и, а также ** и * достоверны, р<0,05.

Во время беременности активность ферментов в сыворотке крови повышалась в 1,5 – 2 раза по сравнению с небеременными женщинами (р<0,05).
Таблица 6. — Активность ферментов в сыворотке крови во время беременности, мкмоль/л•ч, (М±m)

Категории

обследованных

n

Кислые

катепсины

β-D-гликозидаза

Гиалуронидаза

Небеременные

15

1,3±0,18○○

6,4±0,36○○

28 ± 2,3○○

Беременные













7 – 13 нед.

13

2,1±0,29○*

11,4±1,06○*

44±6,7○*

14 – 27 нед.

17

2,3±0,23*

7,7±0,79*

57±6,21*

28 – 37 нед.


15

2,0±0,21*

7,1±0,65*

53±7,77*

38 – 40 нед.

11

6,0±0,59**

17,4±0,51**

106,9±13,78**

Роженицы

17

2,9±0,27*

6,4±1,08*

71±10,1*

Примечание — различия между ○○ и, а также ** и * достоверны, р<0,05.
На протяжении самой беременности она существенно не изменялась вплоть до 38 недель гестации. Накануне родов активность энзимов возрастала в 2 - 3 раза, по сравнению с предшествовавшим неделям гестации. При этом она достоверно превышала таковую как для беременных, так и небеременных женщин (р<0,05). Процесс родов проходил при активности сопоставимой с ее значениями во время беременности до 38 недели гестации (таблица 6).

Таким образом, с наступлением беременности происходила значительная интенсификация метаболических процессов в соединительной ткани шейки матки. На это указывало существенное увеличение (р<0,05) содержания общих ГАГ, падение уровня гексоз (р<0,05) и повышение активности ферментов (p<0,05) в цервикальной слизи.

В сыворотке крови уже в первые недели гестации изменился фракционный состав гликозаминогликанов (p<0,05), возросла активность ферментов (p<0,05). В тоже время уровень общих ГАГ и гексоз остался прежним, что и до беременности.

Формирование родовой доминанты, т.е. угрозы наступления родов, сопровождалось пиком содержания общих ГАГ и их фракций, гексоз гликозаминогликанов, гексоз гликопротеинов, а также активности кислых катепсинов, β-d-гликозидазы и гиалуронидазы в цервикальной слизи, как по отношению к небеременным, так и беременным на всех этапах развития гестации.


В это время происходили клинически наиболее значимые изменения со стороны шейки матки. Она теряла прежнюю плотность, расширялась и укорачивалась. Происходили быстрые и значительные изменения физических свойств в соединительной ткани самой шейки матки, и сопутствовал этому резкий подъем ее метаболической активности.

Во время родов существенных биохимических трансформаций в основном веществе цервикального матрикса шейки матки не происходило. Уровень общих гексоз, гексоз ГАГ и гексоз гликопротеинов сохранялся на том уровне, который был достигнут накануне. Это означало, что сам процесс родов, в отличие от подготовительного периода, или времени угрозы прерывания имел низкую интенсивность метаболизма гликозаминогликанов в этот период.

Гексозы в сыворотке крови не реагировали на беременность, родовые и послеродовые процессы. В то же время они со статистически значимой достоверностью изменялись в цервикальной слизи на протяжении беременности и родов.
Таким образом, на основании полученных данных можно сделать следующие выводы.

1. Гликозаминогликаны, гексозы и ферменты их метаболизма - кислые катепсины, β-d-гликозидаза, гиалуронидаза отражают состояние соединительнотканного остова шейки матки в определенные периоды гестации, накануне родов и в родах.

2. Интенсивность метаболизма соединительной ткани в организме изменяется с наступлением беременности, имеет тенденцию к увеличению с возрастанием срока гестации и достигает своего максимума изменений накануне родов.

3. Созревание шейки матки с перестройкой репродуктивной системы из «состояния сохранения» беременности в «состояние прерывания» (угрозы наступления родов) сопровождается разной ее активностью, с максимальными изменениями исследованных показателей. Родовой акт не сопровождается биохимическими сдвигами в цервикальном матриксе, оставаясь на уровне гестационной стадии.


V.P.Kirilenko, S.L.Voskresenskiy

Biochemical changes in the uterus cervix during pregnancy and labor


State Educational Establishment

The Belarusian Medical Academy of Post-Graduate Education”
Summary: The results of changes in the content of glycosaminoglycans, protein-carbohydrate complexes and activity of lysosomal enzymes in cervical mucosa and blood serum in pregnant women with physiological gestation in the 1st, 2nd, and 3d trimesters before and in labor are presented in this article. It has been established, that significant intensification of metabolic processes in the cervical connective tissue occurred in pregnancy. On the eve of labor, activity of the components studied increased significantly in comparison with the preceding weeks of gestation. During the labor, there were no considerable biochemical transformations in the main substance of cervical matrix of the uterus cervix.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ


1.

Гланц, С. Медико-биологическая статистика: пер. с англ. / С. Гланц. – М.: Практика, 1998. – 459 с.

2.

Зубовская, Е.Т. Активность ферментов и содержание белково-углеводных комплексов (БУК) в сыворотке крови во время беременности и родов / Е.Т. Зубовская., В.С. Камышников, В.П. Кириленко // Практическая гинекология: от новых возможностей к новой стратегии: материалы Междунар. конгр., Москва, 27-31 марта 2006 г. / Науч. центр акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН. – М., 2006. – С. 234.

3.

Кириленко, В.П. Клеточный состав и коллагеновые волокна стромы шейки матки у небеременных, беременных и родильниц / В.П. Кириленко, С.Л. Воскресенский // Патология шейки матки и генитальные инфекции – от теории к практике: тез. докл. Рос. науч.-практ. конф., Москва 26-30 марта 2007 г. / Науч. центр акушерства, гинекологии и перинатологии Федерального Агентства по высокотехн. мед. помощи; под ред. В.Н. Прилепской. – М., 2007. – С. 38-39.


4.

Камышников, В.С. Активность ферментов и содержание белково-углеводных комплексов (БУК) в цервикальной слизи во время беременности и родов / В.С. Камышников, В.П. Кириленко, С.Л. Воскресенский // Практическая гинекология: от новых возможностей к новой стратегии: материалы Междунар. конгр., Москва, 27-31 марта 2006 г. / Науч. центр акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН. – М., 2006. – С. 237-238.

5.

Колб, В.Г. Справочник по клинической химии / В.Г. Колб, В.С. Камышников.– Минск, 1982. – 366 с.

6.

О методике определения суммарного количества кислых мукополисахаридов в сыворотке крови при желтухах / Д.В. Старосельский [и др.] // Лаб. дело. – 1973. - № 3. – С. 149-151.

7.

Определение гиалуронидазной активности / П.Н. Шараев [и др.] // Клин. лаб. диагностика. – 1996. - № 3. – С. 21-22.

8.

Покровский, А.А. Определение активности кислых катепсинов – модифицированный метод Anson / А.А. Покровский, А.И. Арчаков // Современные методы в биохимии: в 2 т. / Под ред. В.Н. Ореховича. – М., 1968. – Т. 2. – С. 48.

9.

Юсипова, Н.А. Активность β-d-глюкозидазы / Н.А. Юсипова // Рационализаторская работа в учреждениях здравоохранения БССР. – 1977. - № 3. – С. 21.

10.

Greiling, H. Die turbdimetrische Bestimmung von Sulfomucopolysacchariden mit Resochin / H. Greiling // Rheumaforsch Z. – 1961. – Bd. 20. – S. 17


Кириленко Виктор Петрович моб: 7577681, служ: 2673544

Воскресенский Сергей Львович моб: 7068009, служ: 2673544