reforef.ru 1


РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ГУ РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

им. Н.Н. БЛОХИНА

На правах рукописи
ПЕТРЕНКО АНАТОЛИЙ АНАТОЛЬЕВИЧ

Анализ метилирования ДНК при раке шейки матки
(Онкология - 14.00.14)

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: профессор, д.б.н. Ф.Л. Киселев

Москва 2003


ОГЛАВЛЕНИЕ
Стр

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
5

ВВЕДЕНИЕ
6

МЕТИЛИРОВАНИЕ ДНК 9

Распространение метилирования ДНК 9

Функция метилирования ДНК 12

Метилирование во время развития 13

Ферменты метилирования 15

Метилирование как динамический процесс 17

Роль метилирования в канцерогенезе 20

Генетическая роль метилирования ДНК в канцерогенезе 22

Эпигенетическая роль метилирования ДНК в канцерогенезе 23

Сравнительный анализ современных методов определения статуса

метилирования ДНК 33

Методы анализа статуса метилирования CpG динуклеотидов 33

Методы идентификации CpG-островков, аберрантно-метилированных в

опухолях 35

Заключение 37

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 38


  1. Список использованных реактивов 38

  2. Клинические материалы 40

  3. Выделение ДНК и РНК из клеточных культур 41

  4. Выделение ДНК из лейкоцитов 41

  5. Рестрикция геномной ДНК 42

  6. Бисульфитная модификация ДНК 43

  7. Полимеразная цепная реакция 43


  1. Праймеры 43

  2. Метилчувствительная ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами 45

7.3. Метилчувствительная ПЦР со специфическими

праймерами 46

7.4. Метилспецифическая ПЦР 46

8. Выделение продуктов ПЦР из гелей 47

  1. Выделение продуктов ПЦР из полиакриламидного геля 47

  2. Выделение продуктов ПЦР из агарозного геля 47


9. Клонирование продуктов ПЦР 47

  1. Вектор 47

  2. Получение компетентных клеток Escherichia coli 48

  3. Трансформация клеток Escherichia coli 49

  4. Выделение плазмидной ДНК 49

10. Гель-электрофорез 50

  1. Электрофоретическое разделение ДНК в агарозном геле 50

  2. Электрофоретическое разделение РНК в агарозном геле 51

  3. Электрофорез ПЦР-амплифицированной ДНК в денатурирующем полиакриламидном геле 52

11. Блот-гибридизация 53

  1. Перенос ДНК на нейлоновую мембрану 53

  2. Перенос РНК на нитроцеллюлозную мембрану 53

  3. Получение меченого зонда 54

  4. Гибридизация ДНК (РНК), иммобилизованной на мембране 54



  1. Обратная транскрипция 55


  2. Переосаждение ДНК (РНК) 55

  3. Анализ нуклеотидных последовательностей 55




  1. Поиск гомологий в банках данных 55

  2. Критерии CpG-островков 56

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 57

1. Поиск CpG-островков, гиперметилированных в опухолях шейки матки 57

  1. Принцип метода метилчувствительной ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами 57

  2. Анализ фрагментов, выявленных с помощью метилчувствительной ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами 63

  3. Определение статуса метилирования CpG-островка 32 при раке шейки матки 70

  4. Определение полного размера CpG-островка гена вЗА-адаптина 72

2. Исследование экспрессии и статуса метилирования гена ЗА-адаптина
при раке шейки матки 76

  1. Исследование экспрессии мРНК гена вЗА-адаптина в опухолях шейки матки и в клеточных линиях рака шейки матки 76

  2. Изучение статуса метилирования CpG-островка гена вЗА-адаптина в

опухолях шейки матки и в клеточных линиях рака шейки матки 78

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 86

ВЫВОДЫ 94

ЛИТЕРАТУРА 95

- 5 -

Список сокращений

MOPS - морфолинпропансульфокислота ДМСО - диметилсульфоксид TEMED - N, N, N', N'- тетраметилэтилендиамин ПСА - персульфат аммония SDS - додецилсульфат натрия IPTG - изопропилтио-|3^-галактозид X-gal - 5-бром-4-хлор-3-индолил-галактозид ЭДТА - этилендиаминтетраацет натрия ГТЦ - гуанидинтиоционат ПААГ - полиакриламидный гель


СП-ПЦР - метилчувствительная ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами

МЧР - метилчувствительная рестриктаза

МЧ-ПЦР - метилчувствительная ПЦР со специфическими праймерами ОТ-ПЦР - обратная транскрипция в сочетании с ПЦР н. п. - нуклеотидных пар

- 6 -Введение

Актуальность темы: Рак шейки матки занимает второе место среди всех онкологических заболеваний у женщин. Этиологическим фактором рака шейки матки (РШМ) признаны вирусы папиллом человека (HPV) из так называемой группы высокого риска (типы 16, 18 и другие). После вирусной инфекции РШМ может развиться через стадии дисплазии, рака in situ на протяжении нескольких лет, в течение которых в прогрессию опухоли вносят вклад возникающие и накапливающиеся изменения в клеточных генах, регулирующих такие важные для нормальной жизнедеятельности клетки процессы, как пролиферация, апоптоз, ангиогенез, поддержание генетической стабильности.

В последнее десятилетие было установлено, что в многостадийном процессе образования опухолей нарушение функций клеточных генов может происходить не только в результате генетических событий (точечные мутации, делеции, амплификация и реарранжировка генов), но и в результате эпигенетических изменений, в том числе локального гиперметилирования ДНК. Аберрантному метилированию в опухолевых клетках подвергаются специфические последовательности - CpG-островки, ассоциированные с 5' регуляторными районами многих генов. В нормальных клетках большинство CpG-островков не метилировано, а их метилирование в опухолевых клетках, как правило, сопровождается подавлением транскрипции соответствующего гена, наследуемой при делении клетки. Механизмы инициации локального метилирования CpG-островков в опухолях пока не ясны.

В последнее время разработаны методы идентификации гиперметилированных районов ДНК, основанные на дифференциальном статусе метилирования CpG-островков в нормальных и опухолевых клетках. Во многих случаях с помощью этих методов были идентифицированы гены, инактивируемые в опухолях путем аберрантного метилирования ассоциированных с ними CpG-островков. Среди них обнаружены как новые гены, утрата функций которых оказалась существенной для развития опухолей, так и известные гены, подавление экспрессии которых в опухолях в отсутствии инактивирующих мутаций уже было продемонстрировано. Число генов, для которых обнаружен альтернативный мутациям эпигенетический механизм инактивации в опухолях, постоянно растет, что свидетельствует о широком распространении этого механизма в процессе канцерогенеза.


Цель настоящей работы: Идентификация гиперметилированных в опухолях шейки матки CpG-островков и ассоциированных с ними генов, экспрессия которых может быть подавлена вследствие нарушения метилирования ДНК.

Исходя из цели работы, были поставлены следующие экспериментальные задачи:


  1. Провести скрининг аберрантно-метилированных GC-богатых последовательностей ДНК в карциномах шейки матки методом метилчувствительной ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами, определить нуклеотидную последовательность обнаруженных GC-богатых фрагментов ДНК, выявить среди них CpG-островки.

  2. Провести поиск в базах данных гомологий выявленных CpG-островков с известными последовательностями ДНК.

  3. В случае отсутствия гомологий CpG-островка с известными последовательностями в базах данных, провести клонирование и определение нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК, фланкирующих CpG-островок для его локализации в геноме человека.

  4. В случае установления ассоциации выявленных CpG-островков с генами, провести анализ статуса метилирования и экспрессии соответствующих генов в первичных опухолях и клеточных линиях карцином шейки матки.

Научная новизна и практическая ценность работы:

С помощью метода метилчувствительной ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами было выявлено 7 GC-богатых фрагментов ДНК длиной от 300 до 1200 пар оснований, пять из которых (более двух третей) обладают свойствами CpG-островков. Из пяти выявленных CpG-островков два оказались непредставленными в опубликованных версиях генома человека: фрагмент 26 был представлен неполностью (отсутствовала область, фланкирующая 5' конец гена /ЗА-адаптина), фрагмент 22 до сих пор отсутствует в опубликованных базах данных.

В работе впервые показано подавление экспрессии мРНК гена /ЗА-адаптина в клеточных линиях рака шейки матки. Продукт гена /ЗА-адаптина представляет собой одну из субъединиц адаптерного комплекса АР-3, вовлеченного во внутриклеточный транспорт белков. Показана возможность восстановления экспрессии мРНК /ЗА-адаптина под действием деметилирующего агента 5-азацитидина, что указывает на связь процессов метилирования и транскрипции гена. Впервые определена нуклеотидная последовательность района, прилегающего к 5' концу гена. Установлены размер первого экзона гена /ЗА-адаптина и размер CpG-островка, ассоциированного с геном. CpG-островок гена /ЗА-адаптина включает 5' нетранскрибируемый район гена, первый экзон и начало первого интрона.


Теоретическое значение работы заключается в получении новых данных об участии клеточных генов в механизме злокачественной трансформации под действием вирусов папиллом человека. Обнаруженное подавление экспрессии гена /ЗА-адаптина в клетках карцином шейки матки указывает на необходимость дальнейшего исследования роли белковых комплексов, вовлеченных в эндо/экзоцитоз белков, в канцерогенезе. Показана возможность идентифицикации CpG-островков, до сих пор не представленных в опубликованных версиях нуклеотидных последовательностей генома человека, с помощью метода метилчувствительной ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами, что позволяет получить информацию о GC-богатых трудноклонируемых районах генома человека.



- 9 -

Метилирование ДНК
Распространение метилирования ДНК.

Метилирование оснований в ДНК было открыто свыше 50 лет назад и наблюдается практически во всех классах живых организмов. ДНК прокариот содержит модифицированные основания ^-метиладенин и 5-метилцитозин, тогда как для эукариот характерно наличие в основном 5-метилцитозина. Он присутствует в ДНК грибов и растений (Finnegan et al. 2000; Martienssen and Colot 2001). В царстве животных наблюдается широкий спектр уровня метилирования генома. На одном из полюсов располагается нематода Caenorhabditis elegans, чей геном лишен 5-метилцитозина и не кодирует соответственно ДНК-метилтрансферазы. Рядом с ней располагается плодовая мушка Drosophila melanogaster. Долгое время считали, что ее геном также не подвергается метилированию. Однако у нее имеется ген, кодирующий белок, гомологичный ДНК-метилтрансферазам млекопитающих (Hung et al. 1999; Tweedie et al. 1999). Недавно было показано, что 5-метилцитозин в ДНК D. melanogaster присутствует в очень малых количествах (Gowher et al. 2000; Lyko et al. 2000). На противоположной стороне от C. elegans находятся позвоночные животные. Их геном имеет самый высокий уровень 5-метилцитозина во всем животном царстве. Метилирование ДНК у позвоночных настолько широко распространено в геноме, что говорят о его тотальном метилировании.


У млекопитающих 5-метилцитозин в геноме встречается практически только в составе CpG динуклеотида. При этом количество CpG динуклеотидов снижено из-за высокой мутабильности 5-метилцитозина, который с высокой вероятностью подвергается спонтанному дезаминированию и превращению в тимин. Это обстоятельство привело в процессе эволюции к многочисленным заменам пар G:C на A:T, в результате чего в геноме млекопитающих динуклеотидов CpG в