reforef.ru   1 2 3 4

ГЛАВА 5 ИЗМЕНЕНИЯ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ПРИ АДАПТАЦИИ ДЕЛЬФИНОВ И ТЮЛЕНЕЙ К УСЛОВИЯМ НЕВОЛИ

5.1 Особенности состава крови адаптированных и неадаптированных к условиям неволи дельфинов афалин

Лейкограмма афалин, как большинства китообразных, (McNeil, 1975; Monte, Pilleri, 1979) и ряда наземных млекопитающих, имеет гранулоцитарный профиль. Количество эозинофилов высоко, часто превышает относительное число лимфоцитов. Базофилы отсутствуют. Между исследованными группами афалин выявлены различия по числу некоторых типов лейкоцитов (табл. 8). Число лимфоцитов у больных животных ниже, чем у здоровых (p<0.01).

Сравнение по нескольким параметрам свидетельствует о существенных различиях между группами афалин (табл. 9).

Таблица 8 Лейкоцитарная формула крови афалин (M±m, пределы колебания)


Группы афалин

Типы лейкоцитов, %

НС

С

Э

Б

М

Л

Здоровые

адаптированные



1.4±0.5

0–5.0


49.2±4.5

24.0–71.0



22.2±2.6

9.0–38.0


0

2.4±0.3

0–4.0


24.7±3.5

11.0–48.0



Здоровые

неадаптированные



3.3±2.2

0–18.0


51.4±7.8

29.0–86.0



17.8±5.0

0–40.0


0

2.1±0.6

0–4.5


25.5±3.9

8.0–42.0


Больные

неадаптированные



3.1±1.1

1–9.0


60.6±5.7

45.0–85.0



20.6±4.5

0.5–36.0


0

1.4±0.5

0–3.5


14.4±2.1

8.5–22.0


Таблица 9 Параметры суммарных распределений лимфоцитов афалин различных групп по цитохимическим признакам (средняя±стандартная ошибка)



Группы дельфинов



НЭ

СДГ

ШИК+




ПН,

%


Число гранул

Число гранул

M

V, %

As

Ex

M

V, %

As

Ex

1



Здоровые

31.1

2.72

76.1

1.69

2.52

21.46

45.3

0.88

0.96

26.7

адаптированные

±1.0

±0.05

±1.8

±0.06

±0.11

±0.33

±1.2

±0.08

±0.16

±1.0

2

Здоровые

30.9

1.85

60.2


1.65

2.43

21.25

42.1

0.75

0.42

19.9

неадаптированные

±1.3

±0.03

±1.6

±0.07

±0.14

±0.36

±1.4

±0.10

±0.20

±1.3

3

Больные

36.5

2.04

63.1

1.44

2.13

18.60

54.1

1.31

2.00

22.6

неадаптированные

±1.1

±0.03

±1.3

±0.05

±0.11

±0.32

±1.4

±0.07

±0.15

±1.0

Примечание. ПН – лимфоциты с парануклеарной реакцией на неспецифическую эстеразу; М – средняя, V – коэффициент вариации (%), As и Ex – показатели асимметрии и эксцесса, соответственно, ШИК+ – содержащие гликоген лимфоциты (%).

Согласно результатам корреляционного анализа (рис. 10, показаны корреляции, достоверные при P≥0.95), наиболее высок уровень скоррелированности характеристик распределения лимфоцитов у здоровых неадаптированных животных. Причем, корреляции (за исключением связи энтропии распределения по активности НЭ и показателя эксцесса по активности СДГ) свидетельствуют об однонаправленности изменений субпопуляционного состава лимфоцитов по активности обоих ферментов. Увеличение среднего числа эстеразоположительных гранул и разнообразия лимфоцитов по этому параметру сопряжено с возрастанием гетерогенности лимфоцитов по активности СДГ (снижается Ex). Сближение субпопуляций с различной активностью ферментов (возрастает Ex), упрощение распределения по активности СДГ (увеличивается R) связано с повышением числа ШИК-положительных лимфоцитов. Знак корреляций соответствует ходу процессов, происходящих при стимуляции лимфоцитов: сначала возрастает активность ферментов лизосом и митохондрий, затем снижается количество гликогена (Хейхоу, Кваглино, 1983

Корреляция Гликоген-СДГ здоровых, здоровых адаптированных и неадаптированных афалин также свидетельствует о зависимости числа гликогенсодержащих лимфоцитов от уровня их разнообразия по активности СДГ: чем он выше (снижаются As, Ex, R), тем ниже содержание ШИК-положительных лимфоцитов. У больных животных существенных корреляций числа ШИК-положительных лимфоцитов и параметров распределения лимфоцитов по активности СДГ не выявлено. Это может быть связано с пониженной эффективностью утилизации гликогена в их клетках, учитывая, что средний уровень активности СДГ у больных афалин снижен.
Рис. 10 Корреляции между параметрами распределений лимфоцитов афалин: ПН – лимфоциты с парануклеарной реакцией на неспецифическую эстеразу; М – средняя; S – среднеквадратичное отклонение; V – коэффициент вариации; As и Ex – показатели асимметрии и эксцесса, соответственно; H – энтропия; R – информационная избыточность.

Корреляции для всей группы животных слабые (r=0.3-0.4), несмотря на статистическую их достоверность (p<0.05). Исключение составляет связь числа лимфоцитов с парануклеарной эстеразной реакцией (ПН) и ШИК-положительных лимфоцитов (r=0.57). Она значительна также у здоровых адаптированных и больных дельфинов. Это, а также сниженная активность СДГ и повышенный процент ПН лимфоцитов у больных животных может свидетельствовать о низкой метаболической активности ПН лимфоцитов афалин.

Увеличение силы корреляций между показателями активности гидролаз и дегидрогеназ лимфоцитов выявлено при аутоиммунных и некоторых профессиональных заболеваниях (Соколов и др., 1975; Робинсон и др., 1986). В то же время, установлено, что животные, отличающиеся высоким уровнем корреляций энзиматических характеристик лимфоцитов, выживают после введения стафилококкового токсина (Катосова и др., 1975). Возрастание силы корреляций метаболических параметров лимфоцитов происходит в ранние сроки после введения антигена при экспериментальной иммунизации (Михайлова и др., 1972). В первые месяцы неволи у дельфинов из-за резкого увеличения обсемененности их микроорганизмами развивается состояние, рассматривающееся как предболезнь (Биркун, 1986). Согласно представленным результатам, оно характеризуется значительными сдвигами в системе иммунитета, проявляющимися в усилении сопряженности процессов активации ферментов лизосом и митохондрий и утилизации гликогена в лимфоцитах. Однако у дельфинов в неволе, в среде с высоким содержанием микроорганизмов, при неблагоприятном влиянии других факторов (стресс, гиподинамия, корм, отличающийся от природного), процессы иммуногенеза часто оказываются недостаточно эффективными.

Выявленные особенности состава лимфоцитов крови по цитохимическим признакам могут быть использованы для контроля течения процесса адаптации дельфинов к условиям неволи и его коррекции препаратами, влияющими на функции и метаболизм лимфоидных клеток. При этом показателем уровня адаптации является степень приближения значений цитохимических параметров и корреляций между ними у адаптирующихся животных к таковым у здоровых адаптированных дельфинов.

5.2 Начальный этап адаптации гренландских тюленей к условиям неволи

Период адаптации морских млекопитающих после отлова и помещения их в неволю может длиться от нескольких недель до нескольких месяцев (Белькович, Гуревич, 1971; Ridgway, 1972; Asper, 1975). Первые недели после отлова считают критическими и во многом определяющими выживаемость и дальнейшую жизнь животных в неволе (Ridgway, 1972).

Общее число лейкоцитов у щенков тюленей в течение периода наблюдения варьировало незначительно: 8.2±1.1, 7.5±1.6 и 7.9±1.3 тыс./мкл (3-й, 10-й и 18-й дни в неволе, соответственно). Процент же лимфоцитов достоверно (р<0.05) упал к третьему дню, а к 18-му снизился в 3 раза по сравнению с контролем (12 интактных щенков такого же возраста, 1-1.5 мес.) и величиной этого показателя у взрослых животных. Достоверное снижение числа эозинофилов наблюдалось в 10-й день (рис. 17). Такие же сдвиги в лейкоцитарной формуле крови происходили у сивучей при адаптации к неволе (Занина, Занин, 1990) и 20-дневном голодании (Коваль Е.З. и др., 1986). Неадаптированные к неволе афалины в первые 3 недели после отлова также имели сниженный уровень лимфоцитов по сравнению с адаптированными здоровыми дельфинами (9.50±4.48% против 20..25±2.42%) (Соколова, 2004). В третий и десятый дни снизился уровень гликогена, а наиболее резкое падение числа эстеразоположительных лимфоцитов отмечено в 10 день (рис. 11).

Рис. 11 Изменения показателей лейкоцитов щенков гренландских тюленей в первые дни содержания в океанариуме: Нф – нейтрофилы; НЭ – эстеразоположительные лимфоциты; Гл – гликоген в лейкоцитах (усл. ед.); Лф – лимфоциты; Эф – эозинофилы.

После того, как щенки начали активно питаться, привыкли к ваннам, в которых они находились, и присутствию людей (18 день пребывания в океанариуме), значения среднего уровня гликогена и числа эстеразоположительных (НЭ+) лимфоцитов восстановились до исходных величин.

Анализ состава лимфоцитов по размеру, форме и числу эстеразоположительных гранул показал, что в первые дни пребывания в океанариуме у щенков существенно (p<0.01) снизилось число клеток с парануклеарным типом реакции, достигнув величины взрослых животных (табл. 10).

Таблица 10 Показатели активности неспецифической эстеразы и организаторов ядрышка гренландских тюленей


Показатель

Группы животных, периоды исследования

Контроль

3-й день

10-й день

18-й день

Взрослые

ПН

52.7±2.0

26.5±2.5

34.2±2.4

24.4±6.5

14.9±2.2

ЭГ

4.10±0.27

3.33±0.21

3.04±0.15

3.14±0.26

3.19±0.22

As

0.867±0.071

0.936±0.087

0.792±0.087

0.861±0.087

1.379±0.077

Ex

0.639±0.141

0.600±0.173

0.529±0.173

0.971±0.173

1.998±0.155

ЯОРAg

1.25±0.02

1.45±0.04

1.36±0.06

1.37±0.06


1.17±0.06

Примечание. ПН – число лимфоцитов (%) с парануклеарной реакцией на НЭ; ЭГ – среднее число эстеразоположительных гранул в 1 лимфоците;; As Ex – показатели асимметрии и эксцесса распределения по числу НЭ+ гранул; ЯОРAg – среднее число окрашенных серебром ЯОР.
В это же время (3-й день в неволе) увеличилась активность организаторов ядрышка, а число эстеразоположительных гранул, отражающее уровень активности лизосомного аппарата клетки, снизилось. Впоследствии рассматриваемые показатели не отличались (p>0.05) от показателей взрослых тюленей, за исключением повысившегося в 10-й день процента ПН лимфоцитов.

Наиболее вероятной причиной резкого падения числа НЭ+ лимфоцитов был стресс, развившийся после транспортировки и помещения животных в ванны. Об этом свидетельствует повышение концентрации глюкозы в плазме крови, сопровождавшее снижение числа эозинофилов (Ерохина, Кавцевич, 1998). При стрессе часть зрелых, дифференцированных Т-лимфоцитов мигрирует в костный мозг, и в популяции клеток крови увеличивается число незрелых, не завершивших дифференцировку лимфоцитов (Юшков и др., 1999). При общей тенденции – снижении числа эстеразоположительных лимфоцитов к 10-му дню пребывания в неволе с последующим его повышением в 18-й день, выявились также индивидуальные особенности изменений этого показателя. В частности, у 2-х тюленей отмечено последовательное возрастание процента Э+ лимфоцитов.

5.3 Изменения цитологических и цитохимических параметров крови гренландских тюленей при длительном содержании в неволе

4 щенка-сеголетка гренландского тюленя в возрасте 3.5-4 месяца, мигрировавшие в Кандалакшский залив, были доставлены в океанариум для длительного содержания и исследования. Некоторые гематологические показатели щенков выходили за пределы возрастной "нормы", предложенной Ф.Р. Энгельгардтом (Engelhardt, 1979). Наиболее существенные отклонения наблюдались у тюленей №2 и №3. Особенно значительным было повышение у них скорости оседания эритроцитов (32-55 мм/час), что могло свидетельствовать о наличии патологического (вероятно, воспалительного) процесса. Кроме того, эти тюлени отличались сниженным числом эритроцитов.

Согласно результатам биохимических исследований (Кавцевич, Ерохина, 2003), у всех животных также было повышено, по сравнению с возрастной нормой, содержание глюкозы, что является одним из показателей стресс-реакции; нарушен минеральный обмен. У щенка № 2, несмотря на нормальную упитанность, наблюдался дисбаланс обмена белка. Оценка состояния животных осложнялась наличием у них гельминтоза (ленточные и круглые черви в желудочно-кишечном тракте).

В результате последующих анализов клеточного состава крови найдено, что наиболее значительно в период наблюдения изменялось абсолютное число эозинофилов (рис. 12).


Рис. 12. Динамика изменения числа эозинофилов у щенков гренландского тюленя.


Длительное содержание животных в контролируемых условиях позволило проследить динамику показателей лейкоцитарной формулы (рис. 13).

Обращает на себя внимание резкое разделение обследованных животных на две группы по характеру динамики лимфоцитов и нейтрофилов. В одну группу вошли тюлени №1 и №2 (успешно прошедшие период адаптации), во вторую – №3 и №4 (погибшие через 18 и 34 месяца пребывания в неволе, соответственно).

Таким образом, динамика клеточного состава крови в течение периода наблюдения у экспериментальных животных резко различается по соотношению уровня лимфоцитов и нейтрофилов. У погибших в разное время тюленей №3 и №4 не наблюдался так называемый "физиологический перекрест", являющийся характерной возрастной особенностью клеточного состава крови млекопитающих. Это позволяет предполагать, что утрата упомянутых выше характерных особенностей может рассматриваться как показатель снижения уровня жизнеспособности детенышей тюленей.

По данным биохимического анализа крови, период реабилитации у щенков гренландского тюленя составил более 3-х месяцев (Кавцевич, Ерохина, 2003, 2009). После года пребывания в неволе отмечена утрата резких индивидуальных различий в биохимическом статусе животных, что, видимо, обусловлено одинаковыми и комфортными по сравнению с природной средой условиями жизни (отсутствие врагов, регулярное кормление, уход, ветеринарное обеспечение).



Рис. 13. Динамика изменения соотношения лейкоцитов различных типов у щенков гренландских тюленей. Ю, П, С – юные, палочкоядерные и сегментоядерные нейтрофилы, Э – эозинофилы; Б – базофилы; М – моноциты; Л – лимфоциты, соответственно.

.В первые месяцы после отлова и помещения в океанариум у животных наблюдались значительные колебания среднего числа ЯОРAg. Далее, по мере взросления тюленей, колебания снизились, и оно приблизилось к уровню взрослых (рис. 14).

Рис. 14. Возрастные изменения числа ЯОРAg в лимфоцитах щенков гренландских тюленей, адаптирующихся к условиям неволи.

Видовой и индивидуальный уровень параметров активности ядрышек устанавливается, вероятно, при половом созревании, которое начинается у гренландских тюленей в 3–4 года.

Стабилизация числа больших гранулярных лимфоцитов и общего числа лейкоцитов произошла в тот же период, что и изменение активности ядрышек (рис. 15). Однако это снижение числа БГЛ, по-видимому, связанное с развитием у молодых тюленей системы специфического иммунитета, у взрослых половозрелых особей 10-15 лет вновь сменяется его повышением (табл. 11).
Что касается числа эстеразоположительных лимфоцитов, большинство из которых являются, предположительно, Т-клетками, то оно изменялось иначе, чем предыдущие 3 показателя. После 9-ти месяцев пребывания в неволе произошло падение ниже исходного уровня, а затем – подъем до уровня, приближающемуся к таковому взрослых животных.

Рис. 15 Динамика изменения числа БГЛ и лейкоцитов.

Таблица 11 Число БГЛ (% от общего числа лимфоцитов) у гренландских тюленей разного возраста



Группы тюленей

M±m

1

Бельки, 1 нед. (n=38)

6.7±0.5

2

Серки, 1.5 мес., n=27

18.0±1.2

3

Серки-"заморыши", 1.5 мес., n=36


19.1±1.3

4

Серки-мигранты, 3-4 мес., n=6

8.6±1.4

5

Взрослые животные, n=10

13.9±1.7

Таким образом, при адаптации изучаемых видов морских млекопитающих к условиям неволи происходят существенные изменения в соотношении лейкоцитов различных типов и в структуре популяции лимфоцитов периферической крови по цитохимическим признакам. Колебания клеточного состава крови у детенышей тюленей зависят от возраста и индивидуальных особенностей состояния животных. Наиболее значительны они в первые недели и месяцы неволи, когда животные подвергаются воздействию стресса, а через10-12 месяцев стабилизируются.

Глава 6 ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ И ЦИТОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ РАЗЛИЧНЫХ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИХ И ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ ФАКТОРОВ

6.1 Отравление обыкновенных морских свиней нефтепродуктами

Мы проводили наблюдения за четырьмя взрослыми самцами обыкновенной морской свиньи, находившимися в воде, загрязненной мазутом. После 6 дней пребывания в загрязненной воде погиб первый дельфин, остальные – через 7, 9 и 10 суток. На третий день наблюдения у трех дельфинов в 1.5–2 раза повысилось общее содержание лейкоцитов, у одного – скорость оседания эритроцитов, т. е. появились признаки острого воспалительного процесса. У одного из дельфинов более чем в 2 раза возросло количество лимфоцитов. В день, предшествовавший гибели, отклонения были наиболее значительными: снизилось количество эозинофилов, что является одним из признаков развития стресс-реакции, у трех дельфинов повысилось число "юных", низкодифференцированных нейтрофилов.

Соотношение лимфоцитов с различным числом эстеразоположительных гранул достоверно изменилось на третий день наблюдения у всех четверых животных (рис. 22). Причем у двух дельфинов уже на второй день значительно повысилось число клеток, содержащих 3 и более гранул. Дельфины, лимфоциты которых проявили более раннюю и сильную реакцию, прожили несколько дольше других.

За день до гибели форма распределения лимфоцитов отличалась от исходной наиболее значительно. Более половины лимфоцитов составили клетки с одной эстеразоположительной гранулой. При этом содержание лимфоцитов с парануклеарной реакцией на неспецифическую эстеразу, низкодифференцированных клеток, не несущих рецепторов Т- или В-лимфоцитов (Соколов, Иванова, 1982), изменялось мало (28.7±2.6, 32.5±2.8 и 31.1±2.2 в разные периоды, соответственно) Таким образом, быстрое (в течение нескольких дней) снижение числа эстеразоположительных гранул свидетельствовало о неспособности лимфоидной системы (и, вероятно, других систем организма) активно реагировать на раздражение.

6.2 Беременность у афалин

В течение 17 месяцев мы наблюдали четырех самок дельфинов-афалин, две из которых были беременны, две – здоровы и небеременны. У одной из беременных имелись, кроме того, симптомы инфекции (примесь гноя в моче). Наличие беременности в период исследования было подтверждено ретроспективно, после рождения доношенных детенышей, учитывая, что ее продолжительность у афалин равна 12 месяцам (Ожаровская, 1982).

Содержание лимфоцитов с "парануклеарным" типом эстеразной реакции было значительно, в 2-2.5 раза, повышено у беременных самок, по сравнению с небеременными, в течение всего срока беременности. Значения этого показателя до наступления беременности составляли у них 31.0 и 33.0%. Число эстеразоположительных гранул у беременной здоровой было снижено, а у беременной больной не отличалось от уровня здоровых (табл. 12).

Таблица 12 Показатели активности неспецифической эстеразы в лимфоцитах беременных и небеременных самок дельфинов афалин


Показатели

№6, небеременная здоровая n=12

№29, небеременная здоровая, n=11

№13, беременная здоровая, n=13

№28., беременная больная, n=10

ПН лимфоциты, %

21.1±1.2

27.8±1.4

64.6±1.4

51.3±1.6

Число гранул в 1 лимфоците

2.77±0.06

2.91±0.06

2.14±0.06

2.71±0.06

Согласно современным представлениям, беременность рассматривается как имплантация генетически чужеродного материала в организм матери. Она сопровождается повышением концентрации ингибиторов пролиферации и дифференцировки лимфоцитов, что приводит к снижению количества иммунокомпетентных клеток. Поэтому повышение числа ПН лимфоцитов при беременности можно считать дополнительным свидетельством того, что и у морских млекопитающих они – низкодифференцированные клетки.

6.3 Изменения клеточного состава крови при инфекционных заболеваниях у гренландского тюленя и белух

В 1986г. в океанариум ММБИ из Архангельска (СевПИНРО) были доставлены 4 щенка гренландского тюленя. По заключению ветеринарного врача, у одного из них началась пневмония. В последующие 10 дней был проведен курс лечения.

Из показателей общего анализа крови наиболее велики в динамике лечения заболевания были колебания общее количество лейкоцитов (табл. 13). При выздоровлении тюленя заметно изменилась лейкоцитарная формула: стало меньше нейтрофилов с несегментированным ядром (низкодифференцированных) и значительно больше эозинофилов. Последнее является, наиболее вероятно, следствием длительного применения высоких доз антибиотиков.

Таблица 13 Показатели общего анализа крови гренландского тюленя, переболевшего пневмонией


Период

Гемоглобин,

г/л


Эритроциты,

106/мкл



Лейкоциты,

103/мкл



Н, %

Э,%

Б,%

М,%

Л,%

несегм.

сегм.

29 июня, лечение

224.0

4.2

30.2

5.5

63.0

3.5

0

7.0

21.0

15 июля, лечение

228.0

4.6

7.4

3.0

60.5

2.0

0.5

6.0

28.0

5 ноября,

выздоровление



222.0

5.2

22.6

1.5

53.5

19.5

0


4.0

21.5

Соотношение групп лимфоцитов с различной активностью неспецифической эстеразы в ходе лечения существенно изменялось. При выздоровлении распределение лимфоцитов по числу эстеразоположительных гранул приобрело асимметричную форму, характерную для здоровых дельфинов и тюленей. Наибольшее среднее число гранул в реакции на неспецифическую эстеразу (5.93±0.30) отмечено 29 июня, в начале лечения, в остальные сроки оно было достоверно ниже (р<0.01). Согласно данным литературы, высокое число эстеразоположительных гранул в активной фазе заболевания отражает возрастание числа и изменение локализации лизосом при стимуляции лимфоцитов. Устойчивое снижение этого показателя и приближение формы распределения лимфоцитов к свойственной здоровым тюленям следует считать, согласно приведенным данным, прогностически благоприятными признаками.

Число лимфоцитов с парануклеарной эстеразной реакцией (ПН) при выздоровлении возросло в 3 раза, превысив уровень здоровых щенков 1.5-месячного возраста (более 50%). Процент ПН лимфоцитов у взрослых гренландских тюленей значительно ниже (14.9±2.2%). Наблюдавшееся после заболевания повышение числа ПН клеток может быть обусловлено и супрессией активно развивавшихся в период заболевания гуморальных иммунологических реакций, и возрастанием количества предшественников зрелых Т-лимфоцитов в связи с прекращением интенсивной антигенной стимуляции системы иммунитета возбудителями заболевания.

В Мурманском морском биологическом институте (поселок Дальние Зеленцы) со



<< предыдущая страница   следующая страница >>